TaMYB4-A关键SNP变异影响
最后，作者想知道TaMYB4-A的不同单倍型是如何影响小麦穗部结构，因此进行关联分析
- SNP-939(
C/T)变异位点位于TaMYB4-A的启动子区，而且刚好在WFZP核心结合基序的下方。该位置的SNP变异可能通过影响WFZP结合从而导致TaMYB4-A表达差异。 - 通过对保守基序的识别，证实了WFZP对TamyB4-A的
抑制作用，在荧光素酶报告试验中，发现烟草叶片的C→T突变消除了这种抑制作用 - 作者进一步选择了两种类型（C型和T型）的33个不同小麦品种，测定了TaMYB4-A的表达量和穗形态
这一结果为SNP变异引起TaMYB4-A表达水平差异进而影响SL和FSPS提供了遗传学依据
- C型：表现出
优良的农艺性状，即SL较长，FSPS较多，TaMYB4-A表达水平显著较高 - T型：表现出SL较短，FSPS较少，TaMYB4-A表达水平较低。
- 此外，作者还想知道TaMYB4-A启动子中的C/T变异位点是如何在我国育种过程中被选择的。于是基于中国小麦微型核心种质的
外显子捕获测序数据，得出：
- 相比于引进品种（45.45%） ，我国地方品种（82.08%）和现代品种（78.18%）携带C型等位基因的种质比例较高。
- 随着育种时间推移，C型的等位基因频率显著升高，表明TaMYB4-A的C型基因在我国育种过程中得到了广泛的应用 ，尤其是1978年以后。
- 自1950年以来，骨干亲本在我国广泛应用于小麦品种改良，包括Zhoumai16, St2422/464, Nanda2419,Nanda2419, St2422/464, Funo, Xiaoyan6, Aimengniu, Zhou8425B, Abbondanza and Lovrin10（图中的十个品种），
21个骨干亲本中有17个在SNP-939位点为C型，除了Aimengniu 和 Lovrin10，这两个亲本的衍生品种在我国广泛种植，这些衍生品种更倾向于从另一个亲本中保留SNP-939的C型。 - 该图是SNP-939在中国不同生态区的等位基因的比例，中国主要小麦种植区的等位基因具有明显的分布特征，以下为T型的占比情况：
- 春小麦区相对较多(≥40%，VI, VII, VIII）
- 其次是冬春混合区（IX和X，分别为22.22%和23.08%）
- 在冬麦区(I、II、III、IV、V)出现频率较低(<20%)
因此，TaMYB4-A的C型等位基因可能来源于中国地方种质，在育种过程中被广泛应用
讨论部分
小麦是最早被驯化的作物之一，驯化与穗部结构变化联系在一起，以利于收获和提高产量。提高产量也是育种的主要目标之一。对于谷类作物来说，穗结构通过影响小穗和小花的发育，在很大程度上决定着籽粒数量,研究控制穗部结构的分子机制将有助于设计育种过程.
作者制作了一个基于时间序列的表观基因组图谱，包括从营养发育到生殖生长过程中各种类型的组蛋白修饰，染色质可及性变化和转录组数据，这将为系统研究小麦穗发育的关键调控因子提供有价值的数据资源。
总之，作者结合多组学数据揭示了小麦穗发育过程中的转录调控网络TRN和表观遗传变化。结合GWAS分析，作者发现了几十个影响小穗结构的新调控因子，揭示了TaMYB4-A启动子内WFZP结合位点的SNP变异在我国小麦育种过程中起着关键作用。
材料与方法
材料：冬小麦品种KN9204
环境：温室
取样：在8个发育阶段，各取10-50个小穗
转基因植株
利用冬小麦品种KN9204进行基因序列扩增，春小麦品种Fielder获得转基因小麦植株
测序数据处理
- reference genome：Chinese Spring-RefSeq v1.0
- FastQC v0.11.8：for ensure the high quality of reads
- BWA-MEM v0.7.17：for ATAC-seq and CUT&Tag seq
- hisat2：短序列比对工具，主要用于RNAseq数据的比对
- Samtools v1.4：进行索引、排序、过滤
- Picard v2.23.3：删除读数中重复项
- deepTools v3.3.0：数据规范化可视化
RNA数据分析
- Counts v2.0.1：计数
- DESeq2 v1.26.0：差异表达分析
- ComplexHeatmap (v2.4.3)：聚类、可视化
- clusterProfiler v3.18.1：基因功能富集
ATAC-seq数据分析
- MACS2 v2.1.4：调用峰
- ChIPseeker v1.26.2：注释峰
- HINT tool v0.13.2：鉴定转录因子变化情况
差异染色质修饰富集区检测
- DiffBind v2.16.2：计算峰值读数
构建基因调控网络
- 通过PCA分析对穗发育过程中表达的基因进行分组
- 计算相邻组之间的欧几里得距离
- 进行坐标缩放，计算基因的拟合曲线
- 根据基因表达情况和标准化的数据，对每个基因进行PCA分析
构建系统发育树
- 利用水稻MADS34和MADS15蛋白序列鉴定小麦和玉米中的同源基因
- MUSCLE v3.8.1551：序列比对
- trimAl v1.4.rev15：筛选氨基酸位置
- RAxML v8.2.12：构建最大似然系统发生树
GWAS全基因组关联分析
- 214份小麦660K单核苷酸序列中筛选出319,558个单核苷酸序列与表型进行关联分析
- Tassel v5.2
- CMplot：Manhattan plots and quantile-quantile plots
基于基因的关联分析
利用287份中国小麦微型核心种质的全基因组外显子捕获测序数据，确定了TaMYB4-A基因6kb区的单核苷酸多态性，包括外显子区、内含子区、4kb启动子区和0.5kb 3'-UTR区。
- Haploview 4.2：计算连锁不平衡，制作LD图
数据获取
- Genome Sequence Archive：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa
- PRJCA013096
荧光素酶实验
LUC荧光素酶，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
荧光素酶基因报告是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
原位杂交
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
END
© 素材来源于网络，侵权请联系后台删除
往期推荐：
