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编辑 | 辰希
活检是肝癌病理诊断的推荐标准。然而，这种方法通常需要切片和染色，以及训练有素的病理学家来解读组织图像。
近日，来自中国科学院大学和温州医科大学的研究团队，利用拉曼光谱研究人体肝组织样本，开发和验证肝癌体外和术中病理诊断的工作流程。通过使用拉曼光谱结合深度学习，以快速、非破坏性和无标签的方式将癌组织与邻近的非肿瘤组织区分开来，并通过组织代谢组学进行验证。
该技术允许对癌组织进行详细的病理鉴定，包括亚型、分化等级和肿瘤分期。基于分子组成的可视化，还可以获取具有亚微米分辨率的未处理人体组织切片的 2D/3D 拉曼图像，这有助于肿瘤边界识别和临床病理诊断。最后，便携式手持拉曼系统在手术过程中用于实时术中人类肝癌诊断的潜力得到了说明。
该研究以「Rapid, label-free histopathological diagnosis of liver cancer based on Raman spectroscopy and deep learning」为题，于 2023 年 1 月 4 日发布在《Nature Communications》上。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35696-2
肝癌是全球第七大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。过去几十年，尽管在诊断和治疗方面取得了重大进展，但全球肝癌新诊断病例的发病率和年龄标化发病率持续上升。
因此，准确、及时的诊断对于肝癌的治疗和生存率的提高至关重要。活检仍被推荐作为病理诊断的金标准，对判断预后和指导治疗具有重要意义。
最近，使用高通量图像分析的数字病理学极大地帮助了病理学家进行组织样本识别和分类。然而，数字病理学的样本制备与传统方法同样存在局限性。因此，需要快速、非破坏性的肝癌体外甚至体内研究技术。
基于拉曼光谱的光谱组织病理学为癌症诊断提供了另一种方法。生物样品的化学结构和组成可以通过拉曼光谱以无污染和非破坏性的方式获得，只需很少的样品制备。光谱信息还可以结合人工智能算法建立诊断分类模型，实现自动诊断。
到目前为止，对于肝癌，基于拉曼光谱的研究主要集中在血液样本的分析上，只有少数研究针对人体组织。
此外，众所周知，肿瘤组织的异质性和可能的癌浸润增加了从组织收集的光谱数据的可变性。因此，有必要从每个组织样本中收集大量的光谱以更好地表示数据，但这可能会增加数据分析的复杂性，并对传统的化学计量学方法提出挑战。深度学习的数据驱动特性非常适合解决这个问题。深度学习可以直接从海量数据中提取和学习隐藏的特征，并已成功应用于图像识别领域，包括生物和医学图像分析。由于其架构的灵活性，深度学习也已扩展到分析一维序列数据，例如光谱数据。
在这项研究中，研究人员报告了使用拉曼光谱探索人类肝病组织。研究得出，拉曼光谱有可能成为肝癌组织病理学诊断的多功能工具，因为它允许基于固有分子振动信号进行快速检测和高化学特异性。
图：基于拉曼光谱和智能算法的肝癌组织病理学诊断工作流程。（来源：论文）
具体而言，肝癌的光谱显示出比从邻近的非肿瘤组织收集的光谱整体强度更弱，并且在不同的病理组织中也观察到不同的拉曼模式，这反映了肝癌进展中生化代谢的复杂性。为了证实这些生化成分在肝细胞癌 (HCC) 组织和邻近组织之间的差异，基于 LC-MS 进行了代谢组学分析，揭示了大多数代谢物在 HCC 组织中表现出下降趋势，例如大多数氨基酸、脂质和核酸，而标有 SFA 或 MUFA 的 PC 增加了。结果与拉曼分析结果一致，表明基于拉曼的代谢组学可以像传统代谢组学一样带来全面可靠的生物学信息，无需额外的耗材，更方便、更经济地区分不同的病理组织。
图：基于深度学习的肝组织拉曼分析和组织病理学诊断。（来源：论文）
首先，使用拉曼光谱结合基于 VGG-16 的卷积神经网络 (CNN)，以快速、无干扰和无标记的方式成功区分肝癌组织和邻近的非肿瘤组织。
结果表明，拉曼光谱结合深度学习可以准确记录和识别不同病理样本中的光谱模式。估计癌组织面积的准确率为 92.6%，灵敏度和特异性分别为 90.8% 和 94.6%。
与其他常见的机器学习算法（包括 PLS-DA、随机森林和 XGBoost）相比，深度学习方法在不同病理类型的组织识别中显示出更优越的计算性能和更高的准确性，特别是在处理不平衡数据时。
表 ：比较 VGG 模型和机器学习算法识别不同病理类型肝组织的能力。（来源：论文）
此外，研究人员还计划在后续工作中研究 HCC 前体和非恶性肝脏病变的鉴别，以及原发性和继发性肝癌的区分，这对肝癌的治疗和预后至关重要。
基于拉曼光谱差异，组织切片的细胞形态可以以无标记的方式描绘。使用自建模曲线分辨率 (SMCR) 和层次聚类分析 (HCA) 算法分析拉曼图像。SMCR 方法可以将未知的拉曼映射数据集解析为纯组分的光谱，同时产生浓度图像和纯光谱。基于 SMCR 方法获得了高质量图像。HCA 是这里使用的另一种化学计量学方法，以更抽象的方式将一组光谱组合成具有相似光谱的簇。HCA 衍生图像的结果与使用 SMCR 处理的结果一致，表明图像处理算法的可靠性。
图：肝组织块的拉曼成像，用于癌切缘勾画。（来源：论文）
这表明亚细胞拉曼分析在简化临床试验期间的癌症诊断方面具有巨大潜力，并为组织病理学诊断提供了前景。
然后对肝癌组织进行更详细的病理鉴定，包括亚型、分化程度和肿瘤分期。组织代谢组学分析证实了拉曼光谱在代谢物鉴定中的可靠性。此外，未处理的人体组织块和组织切片的拉曼图像在亚微米分辨率下允许其分子组成的可视化，有助于肿瘤边界的识别和临床病理学诊断。
最后，在手术过程中使用手持式拉曼光谱系统来探索实时术中肝癌诊断的可行性。成功地验证了便携式拉曼光谱仪在手术过程中区分肿瘤和非肿瘤区域的可行性。这些表明，拉曼技术有可能帮助外科医生在手术过程中快速分析感兴趣的区域，而不会因术中冷冻切片或苏木精-伊红（H&E）染色而中断或延迟。
图：使用手持式光纤耦合拉曼光谱仪进行术中检测。（来源：论文）
值得注意的是，便携式拉曼光谱仪收集的组织拉曼光谱与从微型拉曼光谱仪获得的光谱不同，特别是在某些峰值位置。这可能是由于两种类型的光谱设备之间的差异，例如激光源、激光功率和波长以及光谱仪。不过，虽然两台设备测得的拉曼数据存在差异，但这并不影响拉曼光谱区分癌变与邻近正常组织的能力。
此外，拉曼光谱作为临床工具的实际应用还需要进一步探索和优化。因此，希望能够尽快开发出一种方便的拉曼光谱系统，该系统具有用于准确诊断的归一化标准，以促进其临床采用。
虽然目前的工作是在肝癌的背景下进行的，但同样的方法可用于评估其他器官肿瘤的相似组织学特征。因此，拉曼技术与智能算法相结合，可以应用于肝脏和其他类型肿瘤的诊断，在病理识别和术中指导中发挥潜在的作用。
