今天给大家分享一篇IF=5.4的m6A修饰的文章，2023年5月发表在Frontiers in Endocrinology：Bioinformatics identification and experimental validation of m6A-related diagnostic biomarkers in the subtype classification of blood monocytes from postmenopausal osteoporosis patients，绝经后骨质疏松症患者血液单核细胞亚型分类中 m6A 相关诊断生物标志物的生物信息学鉴定和实验验证
摘要
- 背景：绝经后骨质疏松症（
PMOP）是一种常见的骨骼疾病。现有研究已证实外泌体在调节 RNA N6-甲基腺苷 (m6A) 甲基化中的作用，作为骨质疏松症的治疗方法。然而，源自血清外泌体的 m6A 调节剂在 PMOP 中的作用仍不清楚。基于GSE56815和GSE2208数据集，对m6A调节剂在PMOP诊断生物标志物和亚型识别中的作用进行了综合评估，以探讨m6A调节剂在PMOP中的分子机制。 - 方法：我们进行了一系列生物信息学分析，包括差异分析以识别显着的 m6A 调节剂、随机森林的 m6A 模型构建、支持向量机和列线图、m6A 亚型一致性聚类、差异表达基因 (DEG) 的 GO 和 KEGG 富集分析。用于评估免疫细胞浸润的不同 m6A 模式、主成分分析和单样本基因集富集分析 (
ssGSEA)、通过实时定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 对重要 m6A 调节剂进行实验验证等。 - 结果：在当前的研究中，我们通过GSE56815 和 GSE2208 数据集中的正常患者和 PMOP 患者之间的差异分析，鉴定了 7 个显着的 m6A 调节剂。为了预测 PMOP 的风险，我们采用随机森林模型来识别 7 个诊断性 m6A 调节剂，包括
FTO、FMR1、YTHDC2、HNRNPC、RBM15、RBM15B和WTAP。然后我们选择了 7 个诊断性 m6A 调节剂来构建列线图模型，根据我们后续的决策曲线分析，该模型可以为患者带来益处。我们根据显着的 m6A 调节剂，将 PMOP 患者分为 2 个 m6A 亚型（簇 A 和簇 B）：共识聚类方法。此外，还利用主成分分析来评估每个样本的 m6A 得分，以对 m6A 亚组进行量化。B 组患者的 m6A 评分高于 A 组患者。此外，我们观察到clusterA中的患者与未成熟B细胞和γδT细胞免疫密切相关，而clusterB与单核细胞、中性粒细胞、CD56dim自然杀伤细胞和调节性T细胞免疫相关，与破骨细胞分化密切相关。值得注意的是，通过 RT-qPCR 检测到的 m6A 调节剂的表达水平与生物信息学结果基本一致。 - 结论： m6A调节剂在PMOP的病理过程中发挥整体作用。我们对 m6A 模式的研究可能为未来的 PMOP 治疗提供诊断生物标志物和免疫治疗策略。
分析流程
结果
表 2用于 RT-qPCR 的 m6A 基因特异性引物序列。
图 2 PMOP 中 12 m6A 调制器的标记。
- (A)对照和 PMOP 情况下 12 m6A 调制器的表达热图。
- (B) 12 个 m6A 调节剂的染色体位置。
- (C) 12 m6A 调节剂在对照和 PMOP 病例之间的差异表达箱线图。*p < 0.05，**p < 0.01。
图 3 PMOP (AK)中写入器、读取器和擦除器之间的相关性。
- 写入器：RBM15、RBM15B、METTL3、WTAP和ZC3H13；
- 读取器：ELAVL1、FMR1、HNRNPC、IGFBP3、YTHDC2 和 YTHDF3；
- 擦除器：FTO。
第一次接触rna修饰的小伙伴留意，这里是直译，具体writer写入器：负责加入m6A修饰的蛋白质，Readers读取器: 识别和结合m6A修饰的蛋白质，Eraser擦除器: 负责去除m6A修饰的蛋白质
图4 RF和SVM模型的建立。
- (A)构建残差的反向累积分布以显示 RF 和 SVM 模型的残差分布。
- (B)构建残差箱线图以显示 RF 和 SVM 模型的残差分布。
- (C) ROC 曲线表明 RF 和 SVM 模型的准确性。
- (D)基于 RF 模型的 7 m6A 调制器的重要性得分。
图5列线图模型的建立。
- (A)列线图模型是在 7 个候选 m6A 调制器的基础上建立的。
- (B)使用校准曲线来评估列线图模型的预测准确性。
- (C)基于该列线图模型的决策可能对 PMOP 患者有益。
- (D)临床影响曲线用于评估列线图模型的临床影响。
图 6 PMOP 中 7 个重要 m6A 调节剂的共识聚类。
- (A–D) k = 2–5 时 7 个重要 m6A 调制器的共识矩阵。
- (E) clusterA 和 clusterB 中 7 个重要 m6A 调节剂的表达热图。
- (F) clusterA 和 clusterB 中 7 个重要 m6A 调节剂的差异表达箱线图。
- (G) 7 个重要 m6A 调节剂表达谱的主成分分析显示两种 m6A 模式之间的转录组存在显着差异。（H-I）GO和KEGG分析探讨90个m6A相关DEGs对PMOP发生发展影响的潜在机制。p < 0.05、p < 0.01 和 p < 0.001。
图7单样本基因集富集分析。
- (A)免疫细胞浸润与 7 种重要 m6A 调节剂之间的相关性。
- (B)高 FMR1 蛋白表达组和低 FMR1 蛋白表达组之间浸润免疫细胞丰度的差异。
- (C) clusterA 和 clusterB 之间的差异免疫细胞浸润。p < 0.05、p < 0.01 和 p < 0.001。
图 8 PMOP 中 90 个 m6A 相关 DEG 的共识聚类。
- (A–D) k = 2–5 的 90 个 m6A 相关 DEG 的共识矩阵。
- (E)基因簇A和基因簇B中90个m6A相关DEG的表达热图。
- (F)基因簇 A 和基因簇 B 中 7 个显着 m6A 调节剂的差异表达箱线图。
- (G)基因簇A和基因簇B之间的差异免疫细胞浸润。
- (H) clusterA 和 clusterB 之间 m6A 分数的差异。
- (I)基因簇A和基因簇B之间m6A得分的差异。p < 0.05、p < 0.01 和 p < 0.001。
图 9 m6A 模式在区分 PMOP 中的作用。
- (A)桑基图显示 m6A 模式、m6A 基因模式和 m6A 分数之间的关系。
- (B) clusterA和clusterB之间破骨细胞分化相关基因的差异表达水平。
- (C)基因簇A和基因簇B之间破骨细胞分化相关基因的差异表达水平。p < 0.01，*p < 0.001。
图 10重要 m6A 调节剂的 RT-qPCR 实验验证。
- (A-E)两组之间 5 个关键 m6A 调节剂（包括 FTO、FMR1、YTHDC2、RBM15 和 WTAP）的相对 mRNA 表达。所有结果均表示为平均值±标准差。p < 0.05、p < 0.01 和 p < 0.001。
小总结
- 大概捋一捋：先做差异分析挑出12个m6A调节剂，做了染色体位置和组间表达的表观；各个基因的相关性；SVM和RF筛选出7个核心的调节剂；列线图，校准曲线，DCA曲线；一致性聚类，表达热图，表达箱线图和PCA；GO和KEGG富集分析；ssGSEA，免疫浸润箱线图，在这里挑选出
FMR1分组；聚类分组的差异分析，免疫浸润，m6A评分，组间表达箱线图；最后qPCR验证。 - 行文思路没有拖泥带水，其中
通过一致性聚类，根据7个m6A调节剂聚类出了m6A模式的两簇，以及根据90个m6A相关差异分析聚类出的两个基因簇，最后用PCA计算m6A评分，这一部分笔者觉得挺有意思，小伙伴们可以学习一下。整篇逻辑十分清晰，其实就干了三件事：筛选特征m6A-聚类分簇-验证 - 本篇呐，虽然是前沿之作，但是整个研究思路还是十分值得学习的，感兴趣的小伙伴可以复现一波～
