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数据分析与数据挖掘研究之一 （下）

2022-10-09 638
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简介： 数据分析与数据挖掘研究之一

7、HSP90β基因与免疫调节基因之间的关系


image.png

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8、与HSP90β相关的免疫调节基因的蛋白互作网络


image.png


9、GO及相关通路分析


image.png

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10、整理患者基因表达水平与临床生存信息


#if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
#    install.packages("BiocManager")
#BiocManager::install("limma")
library(limma)           #引用包
expFile="symbol.txt"     #表达数据文件
cliFile="time.txt"       #临床数据文件
geneFile="gene.txt"      #基因列表文件
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\geneimmune\\24mergeTime")     #工作目录（需修改）
#读取表达文件，并对输入文件整理
rt=read.table(expFile, header=T, sep="\t", check.names=F)
rt=as.matrix(rt)
rownames(rt)=rt[,1]
exp=rt[,2:ncol(rt)]
dimnames=list(rownames(exp), colnames(exp))
data=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)), nrow=nrow(exp), dimnames=dimnames)
data=avereps(data)
data=data[rowMeans(data)>0,]
#读取免疫基因的表达量
gene=read.table(geneFile, header=F, sep="\t", check.names=F)
sameGene=intersect(as.vector(gene[,1]), row.names(data))
data=data[sameGene,]
#删掉正常样品
group=sapply(strsplit(colnames(data),"\\-"), "[", 4)
group=sapply(strsplit(group,""), "[", 1)
group=gsub("2", "1", group)
data=data[,group==0]
colnames(data)=gsub("(.*?)\\-(.*?)\\-(.*?)\\-(.*?)\\-.*", "\\1\\-\\2\\-\\3", colnames(data))
data=t(data)
data=avereps(data)
#读取生存数据
cli=read.table(cliFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)     #读取临床文件
#数据合并并输出结果
sameSample=intersect(row.names(data), row.names(cli))
data=data[sameSample,]
cli=cli[sameSample,]
out=cbind(cli,data)
out=cbind(id=row.names(out),out)
write.table(out,file="expTime.txt",sep="\t",row.names=F,quote=F)


11、筛选HSP90β蛋白互作网络中预后相关的免疫调节基因，绘制森林图


#install.packages('survival')
library(survival)          #引用包
coxPfilter=0.05            #显著性过滤标准
inputFile="expTime.txt"    #输入文件
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\geneimmune\\25uniCox")      #设置工作目录
rt=read.table(inputFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)    #读取输入文件
rt$futime=rt$futime/365
rt[,3:ncol(rt)]=log2(rt[,3:ncol(rt)]+1)
#对基因进行循环，找出预后相关的基因
outTab=data.frame()
sigGenes=c("futime","fustat")
for(i in colnames(rt[,3:ncol(rt)])){
  #cox分析
  cox <- coxph(Surv(futime, fustat) ~ rt[,i], data = rt)
  coxSummary = summary(cox)
  coxP=coxSummary$coefficients[,"Pr(>|z|)"]
  #保留预后相关的基因
  if(coxP<coxPfilter){
      sigGenes=c(sigGenes,i)
    outTab=rbind(outTab,
               cbind(id=i,
               HR=coxSummary$conf.int[,"exp(coef)"],
               HR.95L=coxSummary$conf.int[,"lower .95"],
               HR.95H=coxSummary$conf.int[,"upper .95"],
               pvalue=coxSummary$coefficients[,"Pr(>|z|)"])
              )
  }
}
#输出单因素的结果
write.table(outTab,file="uniCox.txt",sep="\t",row.names=F,quote=F)
#输出单因素显著基因的表达量
uniSigExp=rt[,sigGenes]
uniSigExp=cbind(id=row.names(uniSigExp),uniSigExp)
write.table(uniSigExp,file="uniSigExp.txt",sep="\t",row.names=F,quote=F)
############绘制森林图函数############
bioForest=function(coxFile=null, forestFile=null, forestCol=null){
  #读取输入文件
  rt <- read.table(coxFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)
  gene <- rownames(rt)
  hr <- sprintf("%.3f",rt$"HR")
  hrLow  <- sprintf("%.3f",rt$"HR.95L")
  hrHigh <- sprintf("%.3f",rt$"HR.95H")
  Hazard.ratio <- paste0(hr,"(",hrLow,"-",hrHigh,")")
  pVal <- ifelse(rt$pvalue<0.001, "<0.001", sprintf("%.3f", rt$pvalue))
  #输出图形
  pdf(file=forestFile, width=6.5, height=5)
  n <- nrow(rt)
  nRow <- n+1
  ylim <- c(1,nRow)
  layout(matrix(c(1,2),nc=2),width=c(3,2.5))
  #绘制森林图左边的基因信息
  xlim = c(0,3)
  par(mar=c(4,2.5,2,1))
  plot(1,xlim=xlim,ylim=ylim,type="n",axes=F,xlab="",ylab="")
  text.cex=0.8
  text(0,n:1,gene,adj=0,cex=text.cex)
  text(1.5-0.5*0.2,n:1,pVal,adj=1,cex=text.cex);text(1.5-0.5*0.2,n+1,'pvalue',cex=text.cex,font=2,adj=1)
  text(3,n:1,Hazard.ratio,adj=1,cex=text.cex);text(3,n+1,'Hazard ratio',cex=text.cex,font=2,adj=1,)
  #绘制森林图
  par(mar=c(4,1,2,1),mgp=c(2,0.5,0))
  xlim = c(0,max(as.numeric(hrLow),as.numeric(hrHigh)))
  plot(1,xlim=xlim,ylim=ylim,type="n",axes=F,ylab="",xaxs="i",xlab="Hazard ratio")
  arrows(as.numeric(hrLow),n:1,as.numeric(hrHigh),n:1,angle=90,code=3,length=0.05,col="darkblue",lwd=2.5)
  abline(v=1,col="black",lty=2,lwd=2)
  boxcolor = ifelse(as.numeric(hr) > 1, forestCol[1], forestCol[2])
  points(as.numeric(hr), n:1, pch = 15, col = boxcolor, cex=1.6)
  axis(1)
  dev.off()
}
bioForest(coxFile="uniCox.txt", forestFile="forest.pdf", forestCol=c("red","green"))


12、使用筛选出的基因构建预后模型


#install.packages("glmnet")
#install.packages("survival")
#install.packages('survminer')
#引用包
library(glmnet)
library(survival)
library(survminer)
inputFile="uniSigExp.txt"      #单因素显著基因的表达输入文件
setwd("C:\\Users\\lexb4\\Desktop\\geneImmune\\26.model")         #设置工作目录
rt=read.table(inputFile, header=T, sep="\t", row.names=1, check.names=F)    #读取输入文件
#COX模型构建
multiCox=coxph(Surv(futime, fustat) ~ ., data = rt)
multiCox=step(multiCox, direction="both")
multiCoxSum=summary(multiCox)
#输出模型相关信息
outMultiTab=data.frame()
outMultiTab=cbind(
              coef=multiCoxSum$coefficients[,"coef"],
              HR=multiCoxSum$conf.int[,"exp(coef)"],
              HR.95L=multiCoxSum$conf.int[,"lower .95"],
              HR.95H=multiCoxSum$conf.int[,"upper .95"],
              pvalue=multiCoxSum$coefficients[,"Pr(>|z|)"])
outMultiTab=cbind(id=row.names(outMultiTab),outMultiTab)
write.table(outMultiTab, file="multiCox.txt", sep="\t", row.names=F, quote=F)
#输出风险文件
score=predict(multiCox, type="risk", newdata=rt)
coxGene=rownames(multiCoxSum$coefficients)
coxGene=gsub("`", "", coxGene)
outCol=c("futime", "fustat", coxGene)
risk=as.vector(ifelse(score>median(score), "high", "low"))
outTab=cbind(rt[,outCol], riskScore=as.vector(score), risk)
write.table(cbind(id=rownames(outTab),outTab), file="risk.txt", sep="\t", quote=F, row.names=F)
#绘制森林图
pdf(file="multi.forest.pdf", width=10, height=6, onefile=FALSE)
ggforest(multiCox,
     data=rt,
         main = "Hazard ratio",
         cpositions = c(0.02,0.22, 0.4), 
         fontsize = 0.7, 
         refLabel = "reference", 
         noDigits = 2)
dev.off()


image.png


13、绘制该预后模型高低风险组的生存曲线


#install.packages("survival")
#install.packages("survminer")
#引用包
library(survival)
library(survminer)
setwd("C:\\Users\\lexb4\\Desktop\\geneImmune\\27.survival")     #设置工作目录
#定义生存曲线的函数
bioSurvival=function(inputFile=null, outFile=null){
  #读取输入文件
  rt=read.table(inputFile, header=T, sep="\t", check.names=F)
  #比较高低风险组生存差异，得到显著性p值
  diff=survdiff(Surv(futime, fustat) ~ risk, data=rt)
  pValue=1-pchisq(diff$chisq, df=1)
  if(pValue<0.001){
    pValue="p<0.001"
  }else{
    pValue=paste0("p=",sprintf("%.03f",pValue))
  }
  fit <- survfit(Surv(futime, fustat) ~ risk, data = rt)
  #print(surv_median(fit))
  #绘制生存曲线
  surPlot=ggsurvplot(fit, 
               data=rt,
               conf.int=T,
               pval=pValue,
               pval.size=6,
               surv.median.line = "hv",
               legend.title="Risk",
               legend.labs=c("High risk", "Low risk"),
               xlab="Time(years)",
               break.time.by = 1,
               palette=c("red", "blue"),
               risk.table=TRUE,
               risk.table.title="",
               risk.table.col = "strata",
               risk.table.height=.25)
  pdf(file=outFile, onefile=FALSE, width=6.5, height=5.5)
  print(surPlot)
  dev.off()
}
#调用函数，绘制生存曲线
bioSurvival(inputFile="risk.txt", outFile="survival.pdf")


image.png


14、绘制不同的风险曲线


#install.packages("pheatmap")
library(pheatmap)       #引用包
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\geneimmune\\28riskPlot")      #设置工作目录
#定义风险曲线的函数
bioRiskPlot=function(inputFile=null, riskScoreFile=null, survStatFile=null, heatmapFile=null){
  rt=read.table(inputFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)    #读取输入文件
  rt=rt[order(rt$riskScore),]      #按照风险打分对样品排序
  #绘制风险曲线
  riskClass=rt[,"risk"]
  lowLength=length(riskClass[riskClass=="low"])
  highLength=length(riskClass[riskClass=="high"])
  lowMax=max(rt$riskScore[riskClass=="low"])
  line=rt[,"riskScore"]
  line[line>10]=10
  pdf(file=riskScoreFile, width=7, height=4)
  plot(line, type="p", pch=20,
     xlab="Patients (increasing risk socre)", ylab="Risk score",
     col=c(rep("green",lowLength),rep("red",highLength)) )
  abline(h=lowMax,v=lowLength,lty=2)
  legend("topleft", c("High risk", "Low Risk"),bty="n",pch=19,col=c("red","green"),cex=1.2)
  dev.off()
  #绘制生存状态图
  color=as.vector(rt$fustat)
  color[color==1]="red"
  color[color==0]="green"
  pdf(file=survStatFile, width=7, height=4)
  plot(rt$futime, pch=19,
     xlab="Patients (increasing risk socre)", ylab="Survival time (years)",
     col=color)
  legend("topleft", c("Dead", "Alive"),bty="n",pch=19,col=c("red","green"),cex=1.2)
  abline(v=lowLength,lty=2)
  dev.off()
  #绘制风险热图
  rt1=rt[c(3:(ncol(rt)-2))]
  rt1=t(rt1)
  annotation=data.frame(type=rt[,ncol(rt)])
  rownames(annotation)=rownames(rt)
  pdf(file=heatmapFile, width=7, height=4)
  pheatmap(rt1, 
         annotation=annotation, 
         cluster_cols = FALSE,
         cluster_rows = FALSE,
         show_colnames = F,
         scale="row",
         color = colorRampPalette(c(rep("green",3), "white", rep("red",3)))(50),
         fontsize_col=3,
         fontsize=7,
         fontsize_row=8)
  dev.off()
}
#调用函数，绘制风险曲线
bioRiskPlot(inputFile="risk.txt",
            riskScoreFile="riskScore.pdf",
            survStatFile="survStat.pdf",
            heatmapFile="heatmap.pdf")


image.png


15、绘制不同风险因素森林图比较，并进行预后分析


#install.packages('survival')
library(survival)       #引用包
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\geneimmune\\29indep")     #设置工作目录
############绘制森林图函数############
bioForest=function(coxFile=null, forestFile=null, forestCol=null){
  #读取输入文件
  rt <- read.table(coxFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)
  gene <- rownames(rt)
  hr <- sprintf("%.3f",rt$"HR")
  hrLow  <- sprintf("%.3f",rt$"HR.95L")
  hrHigh <- sprintf("%.3f",rt$"HR.95H")
  Hazard.ratio <- paste0(hr,"(",hrLow,"-",hrHigh,")")
  pVal <- ifelse(rt$pvalue<0.001, "<0.001", sprintf("%.3f", rt$pvalue))
  #输出图形
  pdf(file=forestFile, width=6.5, height=4.5)
  n <- nrow(rt)
  nRow <- n+1
  ylim <- c(1,nRow)
  layout(matrix(c(1,2),nc=2),width=c(3,2.5))
  #绘制森林图左边的临床信息
  xlim = c(0,3)
  par(mar=c(4,2.5,2,1))
  plot(1,xlim=xlim,ylim=ylim,type="n",axes=F,xlab="",ylab="")
  text.cex=0.8
  text(0,n:1,gene,adj=0,cex=text.cex)
  text(1.5-0.5*0.2,n:1,pVal,adj=1,cex=text.cex);text(1.5-0.5*0.2,n+1,'pvalue',cex=text.cex,font=2,adj=1)
  text(3.1,n:1,Hazard.ratio,adj=1,cex=text.cex);text(3.1,n+1,'Hazard ratio',cex=text.cex,font=2,adj=1)
  #绘制右边的森林图
  par(mar=c(4,1,2,1),mgp=c(2,0.5,0))
  xlim = c(0,max(as.numeric(hrLow),as.numeric(hrHigh)))
  plot(1,xlim=xlim,ylim=ylim,type="n",axes=F,ylab="",xaxs="i",xlab="Hazard ratio")
  arrows(as.numeric(hrLow),n:1,as.numeric(hrHigh),n:1,angle=90,code=3,length=0.05,col="darkblue",lwd=3)
  abline(v=1, col="black", lty=2, lwd=2)
  boxcolor = ifelse(as.numeric(hr) > 1, forestCol, forestCol)
  points(as.numeric(hr), n:1, pch = 15, col = boxcolor, cex=2)
  axis(1)
  dev.off()
}
############绘制森林图函数############
#定义独立预后分析函数
indep=function(riskFile=null,cliFile=null,uniOutFile=null,multiOutFile=null,uniForest=null,multiForest=null){
  risk=read.table(riskFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)    #读取风险文件
  cli=read.table(cliFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)      #读取临床文件
  #数据合并
  sameSample=intersect(row.names(cli),row.names(risk))
  risk=risk[sameSample,]
  cli=cli[sameSample,]
  rt=cbind(futime=risk[,1], fustat=risk[,2], cli, riskScore=risk[,(ncol(risk)-1)])
  #单因素独立预后分析
  uniTab=data.frame()
  for(i in colnames(rt[,3:ncol(rt)])){
     cox <- coxph(Surv(futime, fustat) ~ rt[,i], data = rt)
     coxSummary = summary(cox)
     uniTab=rbind(uniTab,
                  cbind(id=i,
                  HR=coxSummary$conf.int[,"exp(coef)"],
                  HR.95L=coxSummary$conf.int[,"lower .95"],
                  HR.95H=coxSummary$conf.int[,"upper .95"],
                  pvalue=coxSummary$coefficients[,"Pr(>|z|)"])
                  )
  }
  write.table(uniTab,file=uniOutFile,sep="\t",row.names=F,quote=F)
  bioForest(coxFile=uniOutFile, forestFile=uniForest, forestCol="green")
  #多因素独立预后分析
  uniTab=uniTab[as.numeric(uniTab[,"pvalue"])<1,]
  rt1=rt[,c("futime", "fustat", as.vector(uniTab[,"id"]))]
  multiCox=coxph(Surv(futime, fustat) ~ ., data = rt1)
  multiCoxSum=summary(multiCox)
  multiTab=data.frame()
  multiTab=cbind(
               HR=multiCoxSum$conf.int[,"exp(coef)"],
               HR.95L=multiCoxSum$conf.int[,"lower .95"],
               HR.95H=multiCoxSum$conf.int[,"upper .95"],
               pvalue=multiCoxSum$coefficients[,"Pr(>|z|)"])
  multiTab=cbind(id=row.names(multiTab),multiTab)
  write.table(multiTab,file=multiOutFile,sep="\t",row.names=F,quote=F)
  bioForest(coxFile=multiOutFile, forestFile=multiForest, forestCol="red")
}
#独立预后分析
indep(riskFile="risk.txt",
      cliFile="clinical.txt",
      uniOutFile="uniCox.txt",
      multiOutFile="multiCox.txt",
      uniForest="uniForest.pdf",
      multiForest="multiForest.pdf")


image.png


16、绘制ROC曲线


#install.packages("survival")
#install.packages("survminer")
#install.packages("timeROC")
#引用包
library(survival)
library(survminer)
library(timeROC)
riskFile="risk.txt"        #风险输入文件
cliFile="clinical.txt"     #临床数据文件
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\geneimmune\\30ROC")     #修改工作目录
#读取风险输入文件
risk=read.table(riskFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)
risk=risk[,c("futime", "fustat", "riskScore")]
#读取临床数据文件
cli=read.table(cliFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)
#合并数据
samSample=intersect(row.names(risk), row.names(cli))
risk1=risk[samSample,,drop=F]
cli=cli[samSample,,drop=F]
rt=cbind(risk1, cli)
#定义颜色
bioCol=rainbow(ncol(rt)-1, s=0.9, v=0.9)
#绘制ROC曲线
predictTime=3     #定义预测年限
aucText=c()
pdf(file="ROC.pdf", width=6, height=6)
#绘制风险得分的ROC曲线
i=3
ROC_rt=timeROC(T=rt$futime,
               delta=rt$fustat,
               marker=rt[,i], cause=1,
               weighting='aalen',
               times=c(predictTime),ROC=TRUE)
plot(ROC_rt, time=predictTime, col=bioCol[i-2], title=FALSE, lwd=2)
aucText=c(paste0("Risk", ", AUC=", sprintf("%.3f",ROC_rt$AUC[2])))
abline(0,1)
#对临床数据进行循环，绘制临床数据的ROC曲线
for(i in 4:ncol(rt)){
  ROC_rt=timeROC(T=rt$futime,
           delta=rt$fustat,
           marker=rt[,i], cause=1,
           weighting='aalen',
           times=c(predictTime),ROC=TRUE)
  plot(ROC_rt, time=predictTime, col=bioCol[i-2], title=FALSE, lwd=2, add=TRUE)
  aucText=c(aucText, paste0(colnames(rt)[i],", AUC=",sprintf("%.3f",ROC_rt$AUC[2])))
}
#绘制联合的ROC曲线
multiCox=coxph(Surv(futime, fustat) ~ ., data = rt)
score=predict(multiCox, type="risk", newdata=rt)
ROC_rt=timeROC(T=rt$futime,
         delta=rt$fustat,
         marker=score,cause=1,
         weighting='aalen',
         times=c(predictTime),ROC=TRUE)
plot(ROC_rt, time=predictTime, col=bioCol[ncol(rt)-1], title=FALSE, lwd=2, add=TRUE)
aucText=c(aucText, paste0("Risk+Clinical", ", AUC=", sprintf("%.3f",ROC_rt$AUC[2])))
#绘制图例，得到ROC曲线下的面积
legend("bottomright", aucText,lwd=2,bty="n",col=bioCol[1:(ncol(rt)-1)])
dev.off()


image.png


17、绘制列线图与校准曲线


#install.packages("rms")
library(rms)              #引用包
riskFile="risk.txt"       #风险输入文件
cliFile="clinical.txt"    #临床数据文件
setwd("C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\生信文章\\geneimmune\\31Nomo")     #修改工作目录
#读取风险输入文件
risk=read.table(riskFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)
risk=risk[,c("futime", "fustat", "riskScore")]
#读取临床数据文件
cli=read.table(cliFile, header=T, sep="\t", check.names=F, row.names=1)
#合并数据
samSample=intersect(row.names(risk), row.names(cli))
risk1=risk[samSample,,drop=F]
cli=cli[samSample,,drop=F]
rt=cbind(risk1, cli)
paste(colnames(rt)[3:ncol(rt)],collapse="+")
#数据打包
dd <- datadist(rt)
options(datadist="dd")
#生成函数
f <- cph(Surv(futime, fustat) ~ riskScore+Age+Gender+Grade+Stage+T+M+N, x=T, y=T, surv=T, data=rt, time.inc=1)
surv <- Survival(f)
#建立nomogram
nom <- nomogram(f, fun=list(function(x) surv(1, x), function(x) surv(2, x), function(x) surv(3, x)), 
    lp=F, funlabel=c("1-year survival", "2-year survival", "3-year survival"), 
    maxscale=100, 
    fun.at=c(0.99, 0.9, 0.8, 0.7, 0.5, 0.3,0.1,0.01))  
#nomogram可视化
pdf(file="Nomogram.pdf",height=8.5,width=9.5)
plot(nom)
dev.off()
#calibration curve
time=3    #预测年限
f <- cph(Surv(futime, fustat) ~ riskScore+Age+Gender+Grade+Stage+T+M+N, x=T, y=T, surv=T, data=rt, time.inc=time)
cal <- calibrate(f, cmethod="KM", method="boot", u=time, m=75, B=1000)
pdf(file="calibration.pdf", width=9.5, height=8.5)
plot(cal,
   xlab=paste0("Nomogram-Predicted Probability of ", time, "-Year OS"),
   ylab=paste0("Actual ", time, "-Year OS(proportion)"),
   col="red", sub=T)
dev.off()


image.png


18、最后在ICGC肿瘤数据库中再次验证该模型的准确性，代码与以上类似


image.png

image.png

image.png

image.png

image.png


三、总结：

这里只展示了研究的部分内容，有部分研究结果是使用从在线数据库分析获取的，比如中性粒细胞和CD8阳性T细胞的变化情况。研究整体说明的问题是抑制HSP90β可能会通过调节筛选出的免疫基因来改善肝细胞癌患者的预后，后续可以增加部分验证实验来证明研究结果，通过抑制HSP90β来研究不同免疫基因的改变情况。更详细的研究内容可通过以下访问链接获取：


Gitee码云：


https://gitee.com/wydilearn/effect-of-hsp90-ab1-on-the-local-immune-response-of-hepatocellular-carcinoma


Github：


https://github.com/wydilearn/Effect-of-HSP90AB1-on-the-local-immune-response-of-hepatocellular-carcinoma

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