引言
本系列讲解 空间转录组学 (Spatial Transcriptomics) 相关基础知识与数据分析教程，持续更新，欢迎关注，转发，文末有交流群！
反卷积分析
接下来，我们将对以 16 µm 为单位的 Visium HD 空间转录组数据进行反卷积分析。
加载单细胞参考数据
首先，我们加载与之匹配的 Chromium 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，该数据提供了两种细胞注释分辨率：低分辨率（Level1）将细胞分为 9 类，高分辨率（Level2）则进一步细分为 31 类。
为了确保参考数据与 Visium 数据在转录特征上保持一致，我们仅保留来自 patient 2 的细胞作为参考集。
# retrieve dataset from OSF repository
id <- "Chromium_HumanColon_Oliveira"
pa <- OSTA.data_load(id)
dir.create(td <- tempfile())
unzip(pa, exdir=td)
# read into `SingleCellExperiment`
fs <- list.files(td, full.names=TRUE)
h5 <- grep("h5$", fs, value=TRUE)
sce <- read10xCounts(h5, col.names=TRUE)
# add cell metadata
csv <- grep("csv$", fs, value=TRUE)
cd <- read.csv(csv, row.names=1)
colData(sce)[names(cd)] <- cd[colnames(sce), ]
# use gene symbols as feature names
gs <- rowData(sce)$Symbol
rownames(sce) <- make.unique(gs)
# exclude cells deemed to be of low-quality
sce <- sce[, sce$QCFilter == "Keep"]
# subset cells from same patient
sce <- sce[, grepl("P2", sce$Patient)]
sce
简化 8 µm 注释
我们可以利用单细胞参考注释，将已有的反卷积标注 “DeconLabel1”（对单细胞为最可能的细胞类型，对双细胞为最主要类型）合并为更低分辨率：
i <- match(vhd8$DeconLabel1, sce$Level2)
j <- match(vhd8$DeconLabel2, sce$Level2)
vhd8$.DeconLabel1 <- sce$Level1[i]
vhd8$.DeconLabel2 <- sce$Level1[j]
vhd8 <- vhd8[, !is.na(vhd8$.DeconLabel1)]
table(vhd8$.DeconLabel1)
根据 RCTD，大约 75% 的 8 µm bin 是单态：
round(100*mean(vhd8$DeconClass == "singlet"), 2)
让我们根据“doublet_certain”类检查前 5 个常见双峰对：
dbl <- vhd8$DeconClass == "doublet_certain"
lab <- c(".DeconLabel1", ".DeconLabel2")
df <- data.frame(colData(vhd8)[dbl, lab])
# sort as to ignore order
df <- apply(df, 1, sort)
df <- do.call(rbind, df)
names(df) <- lab
# count unique pairs
ij <- paste(df[, 1], df[, 2], sep=";")
head(sort(table(ij), decreasing=TRUE), 5)
我们可以看到，髓系细胞通常与肿瘤细胞和成纤维细胞共定位；大多数 doublets 是同型的，即它们（主要）由一种低分辨率类型组成。
在 16 µm 分箱上运行 RCTD
我们同样假设每个 16 µm 分箱中最多存在两种细胞类型，如同在 8 µm 中一样，因此预计 singlets 的比例会更小。
# downsample to at most 4,000 cells per cluster for 'sce'
# (this is done only to keep runtime/memory low)
cs <- split(seq_len(ncol(sce)), sce$Level1)
cs <- lapply(cs, \(.) sample(., min(length(.), 4e3)))
ncol(.sce <- sce[, unlist(cs)])
rctd_data <- createRctd(.vhd16, .sce, cell_type_col="Level1")
(res <- runRctd(rctd_data, max_cores=4, rctd_mode="doublet"))
RCTD 推断出的 weight 对应细胞类型的比例，使得对于给定观测它们总和为 1（被排除的观测除外，其总和为 0）：
# counts rejected observations
ws <- assay(res, "weights")
table(colSums(ws) == 0)
# add proportion estimates as metadata
ws <- data.frame(t(as.matrix(ws)))
colData(.vhd16)[names(ws)] <- ws[colnames(.vhd16), ]
接下来，我们可以在空间上可视化反卷积比例估计：
lapply(names(ws), \(.)
plotCoords(.vhd16, annotate=., point_size=0.3, point_shape=15)) |>
wrap_plots(nrow=2, guides="collect") & theme(
legend.key.width=unit(0.5, "lines"),
legend.key.height=unit(1, "lines")) &
scale_color_gradientn(colors=rev(hcl.colors(9, "Rocket")))
我们也可以为 16 µm 分箱获得 majority vote 类别：
# derive majority vote labels
ids <- names(ws)[apply(ws, 1, which.max)]
ids <- gsub("\\.([A-z])", " \\1", ids)
idx <- match(colnames(.vhd16), rownames(ws))
table(.vhd16$.DeconLabel1 <- factor(ids[idx]))
不同分辨率下的反卷积结果
让我们在放大区域可视化 8 µm 和 16 µm 分箱的反卷积结果：
plotVisium(.vhd8,
annotate=".DeconLabel1", zoom=TRUE,
point_size=0.8, point_shape=22) +
ggtitle("8 µm") +
plot_spacer() +
plotVisium(.vhd16,
annotate=".DeconLabel1", zoom=TRUE,
point_size=1.6, point_shape=22) +
ggtitle("16 µm") +
plot_layout(nrow=1, guides="collect", widths=c(1, 0.05, 1)) &
guides(col=guide_legend(override.aes=list(size=2))) &
scale_fill_manual(values=unname(pals::trubetskoy())) &
facet_null() & theme(
plot.title=element_text(hjust=0.5),
legend.key.size=unit(0, "lines"))
我们观察到，在 8 µm 和 16 µm 两种分辨率下，反卷积结果高度一致；然而，8 µm 分辨率能更精细地捕捉结构，例如内皮细胞和成纤维细胞呈“细线状”伸入左上角肿瘤区域的分箱。
