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维度确定
为了克服 scRNA-seq 数据的任何单个特征中广泛的技术噪音，Seurat 根据 PCA 分数对细胞进行聚类，每个 PC 本质上代表一个“元特征”，它结合了相关特征集的信息。因此，顶部主成分代表了数据集的稳健压缩。但是，我们应该选择包含多少个成分？ 10？ 20？ 100？
在 Macosko等人中，我们实施了受 JackStraw 程序启发的重采样测试。虽然 Seurat 中仍然可用，但这是一个缓慢且计算成本高昂的过程，并且我们不再用于单细胞分析。
另一种启发式方法生成“Elbow plot”：根据每个主成分解释的方差百分比对主成分进行排名（ElbowPlot() 函数）。在此示例中，我们可以观察到 PC9-10 周围有一个“Elbow”，这表明大部分真实信号是在前 10 个 PC 中捕获的。
ElbowPlot(pbmc)
识别数据集的真实维度——对于用户来说可能具有挑战性/不确定性。因此，我们向用户建议采用多种方法。第一个是更多的监督，探索 PC 以确定异质性的相关来源，并且可以与 GSEA 等结合使用。第二个（ElbowPlot） 第三个是常用的启发式，可以立即计算。
在此示例中，我们可能选择 PC 7-12 之间的任何值作为截止值。
我们在这里选择了 10 个，但鼓励用户考虑以下事项：
- 树突状细胞和 NK 与 PC 12 和 13 密切相关的基因定义了罕见的免疫子集（即 MZB1 是浆细胞样 DC 的标记）。然而，这些组非常罕见，在没有先验知识的情况下，很难将它们与这种大小的数据集的背景噪声区分开来。
- 鼓励用户使用不同数量的 PC（10、15，甚至 50！）重复下游分析。
- 用户在选择该参数时偏高。例如，使用 5 PCs 执行下游分析会对结果产生重大不利影响，这将提醒用户重新分析与思考。
细胞聚类
Seurat 应用基于图的聚类方法，以（Macosko 等人）中的初始策略为基础。重要的是，驱动聚类分析（基于先前识别的 PC）的距离度量保持不变。然而，我们将细胞距离矩阵划分为簇的方法已得到显着改进。
Seurat 的方法深受最近手稿的启发，该手稿将基于图的聚类方法应用于 scRNA-seq 数据和 CyTOF 数据 。简而言之，这些方法将cell嵌入到图结构中 - 例如 K 最近邻 (KNN) 图，在具有相似特征表达模式的cell之间绘制边缘，然后尝试将该图划分为高度互连的quasi-cliques’ 或 ‘communities’。
与 PhenoGraph 一样，我们首先基于 PCA 空间中的欧氏距离构建 KNN 图，并根据局部邻域中的共享重叠（杰卡德相似度）细化任意两个单元之间的边缘权重。此步骤使用 FindNeighbors() 函数执行，并将先前定义的数据集维度（前 10 个 PC）作为输入。
为了对cell进行聚类，我们接下来应用模块化技术，例如 Louvain 算法（默认）或 SLM，迭代地将细胞分组在一起，目标是优化标准模块化函数。 FindClusters() 函数实现此过程，并包含一个分辨率参数，用于设置下游聚类的“粒度”，增加的值会导致更多的聚类。我们发现，将此参数设置在 0.4-1.2 之间通常会为大约 3K 细胞的单细胞数据集带来良好的结果。对于较大的数据集，最佳分辨率通常会增加。可以使用 Idents() 函数找到簇。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 2638
## Number of edges: 95965
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8723
## Number of communities: 9
## Elapsed time: 0 seconds
# Look at cluster IDs of the first 5 cells
head(Idents(pbmc), 5)
## AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1
## 2 3 2 1
## AAACCGTGTATGCG-1
## 6
## Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8
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