RNA测序（RNA-seq）已经成为分析基因差异表达和mRNAs差异剪接不可或缺的工具。随着下一代测序技术的发展，RNA-seq也在发展。
目前，RNA-seq方法可用于研究RNA生物学的许多不同方面，包括单细胞基因表达、翻译和RNA结构。随着直接RNA-seq技术和更好的数据分析工具的出现，RNA-seq的发展有助于更全面地理解生物科学，本文分享一篇2019年发表在Nature的RNA-sequencing综述。
DGE：基因差异表达
流程 ：
RNA提取→mRNA富集或rRNA耗尽→cDNA合成→适配器连接→测序文制备→ 高通量平台（通常是Illumina）上进行测序，每个样本的读深度为1000万-3000万。
将测序读数对齐组合到一个反义读数→量化与转录本重叠的读数→样本之间的过滤和归一化→构建样本组之间单个基因或转录本表达水平的显著变化的统计模型。早期的RNA-SEQ实验从大量组织中产生了DGE数据，并证明了它在广泛的生物和系统中的应用。
RNA-SEQ经常被用作不同的生物学应用，DGE分析（差异表达分析）仍然是RNA-SEQ的主要应用。
本文中，首先介绍了DGE的“基本准则”短读RNA-SEQ分析，然后将标准短读方法与新兴的长读RNA-SEQ和dRNA-SEQ技术进行比较。描述了短读排序建库的发展、实验设计和工作流。还有单细胞测序和空间分辨转录组分析。以及转录和翻译动力学、RNA结构、RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用的分析。最后，讨论了RNA-SEQ未来可能的发展前景，单细胞测序和空间RNA-SEQ方法是否会像DGE分析一样成为常规？RNA-SEQ分析的长读可能在什么领域取代短读？
短读测序技术
目前短读测序技术已经成为常用的转录组检测方法，主要的核心步骤：RNA提取→cDNA合成→接头连接→PCR扩增→测序分析。由于片段化产生的cDNA长度通常小于200bp。例如illumina技术
长度测序技术
能够对单个RNA分子进行测序，减少序列测定中的歧义性，降低假阳性率。例如pacbio技术
长读直接测序技术
dRNA-seq，直接用RNA进行测序，消除逆转录过程的偏差，产生超过100bp的读取长度。
优点：改进了异构体检测性能、可用于估计polyA尾长。
比较长读和短读技术
- 长读：缺点是通量低、错误率高。优点是能够读取单个转录本。
- 短读：优点是通量高，测序规模大，差异基因表达敏感性强。
长读测序的一个重要的问题——错误率比较高，如果每个样品被单独多次测序，再通过计算处理成一致序列，那么分子测序的次数的越多，错误程度越低。长度测序的灵敏度受到三个因素影响：长RNA分子以全长转录组形式存在，即使低水平的RNA降解也会限制测序；文库制备技术限制，常用的逆转录酶无法满足实验需求；测序平台发展限制。
改进构建文库方法
RNA-seq最初用于分析聚腺苷酸转录本，方法源自于表达序列标签和微阵列研究。然而这些技术具有一定局限性。
- cDNA合成前对RNA进行片段化处理，提升丰度估计的准确性。
- 链特异性文库，测序时利用oligo-dT富集、UMIs特异性标注，利于实验分析。
富集poly（A）尾巴
多数转录组测序结果都是从oligo-dT富集mRNA中获得，它含有多聚poly A的尾巴，测序的重点在转录组的蛋白质编码区。
许多非编码RNA（比如miRNA和enhancer RNA）不是多聚核苷酸，因此无法用该法研究。我们可以选择用oligo-dT法或者rRNA降解法（WTA），前者不能获取短的非编码RNA，后者需要特定的miRNA.
WTA通过编码和一些非编码RNAs产生RNA-seq数据，它与降解样品相容，导致poly A和转录本分离，rRNA的去除通过RNase H酶特异性实现。oligo-dT和rRNA降解法（WTA）都可以用于DGE研究，后者可以检测到更多转录本，但是贵！
富集3'端用于标记和选择
短读测序需要每个样本1000万-3000万的读数才能进行高质量的DGE分析，对于资源有限的朋友来说，可以考虑用3'-tag计数，降低成本同时得到更多数据。
每个转录本从3'端开始生成一个片段，标签的丰度与RNA浓度呈正比，这称为标签测序协议。
富集转录起始位点5'末端
TSS:转录起始位点
该法利用生物素化模板转换寡聚核苷酸产生cDNA,然后在5'端附近片段化，产生短cDNA标签。如果只用该法会产生大量假阳性TSS峰，建议使用正交法进行验证确认。
应用分子标识符检测PCR重复
RNA-seq数据通常具有很高的重复率，许多读数映射到转录组的同一位置。
在全基因组测序中，重复读数代表PCR失误而被删除。而转录组测序中，重复代表真实的生物信号被保留。后者需注意只有一对片段的一段必须相同，才能确定其为重复序列。
UMIs:独特分子识别符，在文库制备过程中添加的短序列，其直接与RNA连接。
UMIs改善数据分析的错误率，放大偏差，消除可能导致等位基因频率计算错误的人工扩增制品，其正成为单细胞测序文库制备的标准工具之一。
改进降解RNA分析方法
文库制备的发展改善了对低质量或降解RNA的分析，以往的低质量RNA会导致基因覆盖不均匀、DGE假阳性高、重复率高。转录组文库构建可以用来降低RNA降解的影响。
设计更好的转录组实验
实验的设计对结论和数据至关重要，需要考虑复制次数、测序读取深度、单末端或者双末端读取的选择。
确定复制次数
足够多的生物复制能够获得更加精确的信息，解读生物变异性，任何高通量RNA实验都必须以复制的方式进行，在确定最佳复制次数时应该考虑到：效应大小、组内变异、预期假阳性率、最大样本量等。
确定正确的复制次数并不容易，对于高度多样化的样本，需要更多的复制，以确定变化规律。
确定读取深度
建库完成后，需要决定进行多深的测序？读取深度指每个样本获得的序列读取目标数目。真核生物DGE实验每个样本大约需要1000万-3000万左右。每个样本的读数能提供转录本丰度估计值，如果有足够的复制次数，那么较少的测序即可解决实验问题。
选择合适的参数
- 读取长度越长，测序DNA覆盖程度越高。对于定量分析如DGE时，长读没有太大作用。但对定性分析如异构体，则可能有帮助。
- 单末端读取和双末端读取也相类似，前者每个cDNA片段只产生一个序列，后者产生俩。若需要更多核苷酸覆盖度分析，长读和双末端测序是首选！DGE分析只需要计算读数映射，单末端测序即可确定大部分基因的源头，另外，双末端测序可以帮助解决映射歧义问题。
RNA-seq数据分析流程
↓ ↓ ↓转录组差异表达分析常用软件工具
分析序列读数的方法非常多，不同的工具和方法对结果产生不同影响，使用最佳的工具能帮助我们解决更多问题。DGE差异表达分析常用四个步骤，分别是：对齐、组装、量化、归一化、构建模型。
第一步：序列对齐与组装
测序产生fastq格式原始文件，首先将序列映射到已知的转录组或者基因组，这个过程使用TopHat,STAR,HISAT等工具完成。测序的cDNA来自RNA，因此可能跨过外显子边界，执行剪切对比时，允许读数间隙。
如果没有高质量基因组注释可用或者希望映射到转录本时，可以使用StringTie,SOAPdenovo-Trans工具。
- 流程A：hisat→htseq→TMM→edgeR
- 流程B：Kallisto→TXI→TMM→DESeq2
- 流程C：tophat→cufflinks→cuffdiff2
tips：如果基因组注释缺失或者不完整时，选择从头组装的工具。
新软件：Sailfish118, Kallisto119，Salmon【计算效率高、免费、直接映射不需要单独量化步骤、适用于较长的转录本、在低丰度转录本方面不准确】
第二步：转录本丰度量化
一旦序列读数被映射到转录组或基因组的位置上，即可将其分配到基因组或转录本确定丰度。量化采用的方法会对结果产生重大影响，利用转录组注释信息与已知的基因重叠信息进行计数，得出单个基因所有转录本异构体的丰度信息。
短读序列不会跨过剪接链接，因此不能分配明确的异构体，不同基因长度的异构体之间差异表达可能导致更准确的结果。
常用的工具：e RSEM,CuffLinks,MMSeq,HTSeq同源和重叠的转录本可能从分析中排除。
表达矩阵：Express Matrix
每一行是表达特征（基因或者转录本） 每一列是一个样本 值是实际读数或者估计丰度
第三步：过滤和归一化
通常，量化之后的读数也需要进行过滤和归一化，用来说明读取深度、表达模式、技术偏差之间的差异。
- 过滤：去除低丰度重复、改善检测结果
- 归一化：规范表达矩阵，转化丰度量，校正细微差异
尖峰控制：在处理前添加已知浓度的外源核酸序列，它们能够以不同浓度分布，用于检测反应效率和误差假阳性校正。
归一化的两个关键假设：
- 多数基因表达水平在复制组间保持稳定
- 不同样本在总mRNA水平没有显著差异
若以上两个假设不成立，则需要借助TMM均值修剪法，包括edgeR差异表达分析来弥补。选择合适的归一化方法：尝试运用多种方式进行分析，对比结果的一致性，若差异较大，应进一步探索，找出差异来源。
另外一种解决方式是尖峰控制RNAs：在文库制备过程中，预先引入合适的外来RNA序列，尖峰插入RNA变异体，由于尖峰的浓度已知，读数和浓度呈正相关，因此可以用于校准样本的表达水平。
但是，实际过程中，在预定水平一致的插入尖峰很困难，在基因层面的读数比转录层面更可靠，因为异构体可以在样本中以不同的浓度表达。目前，尖峰控制并没有广泛使用，少量应用于单细胞测序领域。
第四步：差异表达建模
当序列被处理成表达矩阵后，实验即可被建模，从而确定哪些复制信息可能影响到表达水平。一些模型读取基因水平表达的计数，另一些模型依赖于转录水平的估计。前者以利于对齐的计数，并使用广义线性模型来进行评估。
工具：edgeR, DESeq2 and limma+voom 建模差异亚型表达量的工具：CuffDiff，MMSEQ，Ballgown。需要更多的计算量，结果也有较大变化。但是实际上前期的对齐、过滤、归一化等步骤对结果的影响更大！
