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单细胞免疫组库可以额外做啥？
scTCR可以更细致的获取肿瘤免疫微环境的变化，比如单细胞转录组可以获取不同样本，不同分组（癌和癌旁，是否治疗，是否响应）的celltype组成，可以知道哪些celltype发生变化。
而TCR可以进一步的得知发生变化的celltype中clone扩展情况如何，治疗响应组中clone是变多了还是变少了？不同celltype之间是否共享一些clone？是否出现了noval的clone？clone最多的TCR序列是哪些？这些序列和哪些peptide结合最强？是否可以用于CAR-T或者TAR-T治疗等等。
本系列会使用2021年Cancer Cell文章“Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy”中的部分样本作为示例展示TCR的常见应用场景以及可视化。
该数据集的多个样本都有多处采样位置，多数样本同时含有RNA和TCR数据，且含有治疗前后的数据，ICB响应与否的数据，非常适合免疫组库系列分析的练习。
一 数据集下载
Pubmed中找到该文章，然后在Data Availability Statement 中发现文章的原始数据在PRJNA705464，下载原始的sra文件来开启 “从0开始scVDJ”的系列分析。
1，数据集下载
在浏览器输入https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/，在Accession 中输入BioProject的ID号（PRJNA705464）， 下拉找到以下信息，就可以开始下载了，介绍以下两种下载方式
（1）可以点击具体的Run，然后找到Data Access ，获取下载链接后进行下载。
（2）也可以获取第一列的SRR信息，使用SRAToolkit的prefetch进行批量下载
1.1 安装SRAToolkit
可以在https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit的链接中选择合适的SRAToolkit下载 或者通过wget方式获取
wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/3.0.2/sratoolkit.3.0.2-centos_linux64.tar.gz tar zxvf sratoolkit.3.0.2-centos_linux64.tar.gz
1.2 prefetch下载数据
（1）单个Run下载
prefetch 后面添加上SRR的ID号即可 ，prefetch建议使用绝对路径 , 可以添加--max-size 100G 参数。
/path/prefetch SRR13806045 --max-size 100G
（2）SRR_ACC_List 批量下载（一列SRR编号的文件）
/path/prefetch --option-file SRR_ACC_List.txt
（3）shell循环下载
cat SRR_ACC_List.txt |while read i; do /path/prefetch $i done
软件建议使用绝对路径。
2 sra文件转为fastq
使用sratoolkit中的fastq-dump命令将 sra 转化为 fastq 文件。
进入到sra数据的存储文件夹中，可以用下述代码进行批量的格式转化：
cat SRR_ACC_List.txt |while read i; do /path/.../fastq-dump --split-3 $i done
注：--split-3 filename其中--split-3参数代表着如果是单端测序就生成一个 .fastq文件，如果是双端测序就生成_1.fastq 和*_2.fastq 文件。
3 修改cellranger 输入格式
得到fastq文件后，还需要转为cellrange 分析需要的格式（比如，将得到的SRR_1.fastq.gz改为SRR_S1_L001_I1_001.fastq.gz）。
可以使用上述方式进行批量修改，但是要注意生成文件的个数，如果像本示例中产生的是R1和R2文件，那就将原来_1的改成R1，将_2改成R2。
#创建SRR_ACC_List.txt ，内容为SRR号 cat SRR_ACC_List.txt| while read i ;do mv ${i}_1*.fastq.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz; mv ${i}_2*.fastq.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz); done
注：样本名称不要有下划线"_"，可以是短线"-"。
二 cellranger分析
首先进行cellranger的下载和安装，参照10X官网https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in 或者 单细胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 开启单细胞之旅（上）
1 scRNA分析
首先下载refdata文件，然后解压
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
进行cellranger count分析
/path/cellranger count --id=sample1 \ --transcriptome=/path/.../refdata-gex-GRCh38-2020-A \ --fastqs=/path/.../fastq_path \ --sample=sample1 \ --expect-cells=1000 \
运行结果在outs文件夹，建议每个文件都在官网中查一下大概的含义，这里重点关注outs/filtered_feature_bc_matrix文件夹， 单细胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 开启单细胞之旅（上）
2 scVDJ分析
首先下载V(D)J reference文件，然后解压
curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-vdj/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0.tar.gz tar -xf refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0.tar.gz
进行cellranger vdj分析
/path/cellranger vdj --id=sample1 \ --reference=/path/.../refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0 \ --fastqs=/path/.../data \ #fastq文件所在路径 --sample=sample1 \ #第一个下划线之前的样本信息 --localcores=8 \ --localmem=64 \
运行结果在outs文件夹，文件很多，建议根据https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/software/pipelines/latest/output/overview了解以下每个文件的意义。outs/filtered_contig_annotations.csv文件，更需要重点了解每一列的意义。
以上，得到每个样本的单细胞RNA和TCR的结果后就可以使用scRepertoire 或者STARTRAC 进行免疫组库以及T细胞动态等分析了。
这些分析后续会进行系统的介绍。
