如何使用高通量测序检测T-DNA插入

之前拿到了一批混池测序的数据，师兄除了让我帮他找一个突变位点，还让我顺便检查下基因组上的T-DNA插入。我去查了一下相关资料，已经有人那么干了，这里简要说明一下步骤。

TITLE: Illumina Sequencing Technology as a Method of Identifying T-DNA Insertion Loci in ActivationTagged Arabidopsis thaliana Plants

正向遗传筛选是植物研究的利器，目前比较常用有EMS诱变和T-DNA插入两种方式。其中EMS诱变通常会产生G->A, T->C点突变，利用高通量测序的方法从中寻找目标突变已经有了比较成熟的体系，叫做mapping-by-sequencing。 而T-DNA插入的检测，一般都采用 thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)方法，高通量测序用的也比较少。当然高通量测序也是能够搞定的，就是稍微麻烦一点。

注意：一定要用双端测序，当然目前标配都是PE100或PE150。

第一步：分别将forward read和reverse reads比对到拟南芥参考基因组和T-DNA序列上。当时是PE50，作者使用了bowtie，目前推荐bwa mem。因此每条序列都会有其在拟南芥或T-DNA序列的位置信息和方向信息。

作者并没有明说forward read和reverse read 分别比对到两个参考序列上，还是把T-DNA加入到拟南芥的参考基因组中再比对。我个人认为是后者。

第二步：比对上的read根据ID信息进行配对，这样子对于T-DNA插入附近的序列，配对得到的fragment有如下三种情况（如图）

• PE reads都属于拟南芥基因组
• PE reads都来自于T-DNA
• PE reads一条是拟南芥，一条是T-DNA

Illustration of the possible reads obtained with Illumina sequencing

第三步：提取未比对的序列（这些序列可能处于断点处,breakpoints，所以可能无法比对上）和第二步中第三种序列使用BLAST到拟南芥和T-DNA参考序列上，寻找准确的位置

最后作者找到3个主要的breakpoints，有多于两条以上的PE read支持和7个只有一条PE read支持的breakpoint.

Read for breakpoint 1, which maps over the breakpoint

最后，作者根据这些PE read在两端涉及引物进行PCR扩增验证。

得到

最后说下我读这篇文章的一些收获：

• 第一， 这篇文章思路很清晰，尤其是三种可能的比对模式的分类帮我打开了思路，我原本认为是要把未比对的序列 de novo 组装一下才能找到 T-DNA插入。
• 第二，原来是PE50测序，会导致一些处在break point的read比不上去，而现在都是PE100+, 使用bwa mem会有一类soft clip read，并且bwa mem 使用supplementary来记录“chimeric alignment”，可以基于supplementary简化第二步
• 第三，作者这个思路来自于玉米的永不停歇的转座子插入分析，所以要多看文献，提高姿势

当然这篇文章还打破了我一定要 de novo 的思维定势，于是我想到了其实可以把没有比对到参考基因组的序列提和soft-clip的序列取出来比对到T-DNA序列上，排除那些完全比对到T-DNA序列的read，剩下blast就行了。这个思路是如此水到渠成，所以2017年已经有文章发表了，"Genetic characterization of T-DNA insertions in the genome of the Arabidopsis thaliana sumo1/2 knock-down line"，思路图如下

Identification of the 2 amiR-SUMO2 insertion sites using NGS sequencing