今天分享DNA测序技术和原理，包括illumina和pacbio测序原理、基本介绍和优缺点对比。
Illumina测序技术
- 原理：边合成边测序
- 测序长度：150bp
- 通量：6TB
测序原理
文库构建
- DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建
- 流程及其原理：末端修饰-添加接头-磁珠纯化-PCR扩增-磁珠纯化
- 测序是以单链为单位的，建库完成后的每条DNA的单链均一端连有测序引物-Rd1Sp和P5，另一端为Rd2 SP、Index和P7。
- Index用来区分不同的文库，因为测序仪一个run产生数据量巨大，由于实际情况不同，一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上Index来区分。
上机测序
- 三个系统：
温度控制系统；酶控制系统；荧光信号收集系统
- 过程：
首先以寡核苷酸为引物、文库片段为模板进行DNA复制，复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的为与文库模板互补的DNA链。
因为单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，之后进行“桥”式扩增。
桥式扩增后一个DNA簇都是由最初的一个文库模板复制而来，但是这时候P7上的序列与P5上的序列是分别从两端开始的，测序要保证每个片段一致性，因此再次解链线性化，切割并洗去P5上的DNA链，只留P7上的DNA单链。
加入测序引物Read1 SP和修饰过的DNA聚合酶，则在测序引物3’端开始DNA复制。
双末端测序，进行另一个方向的测序，洗掉前面复制合成的片段，从另一端进行序列读取。
测序数据
优缺点
- 优点： 一次能够同时得到大量的序列数据，相比于一代测序技术，通量提高了成千上万倍；单条序列成本非常低廉
- 缺点： 序列读长较短，Illumina平台最长为250-300bp
Pacbio测序技术
- 原理：边合成边测序
- 测序长度：30kb
- 通量：20GB
测序原理
单分子实时测序SMRT
SMRT 中有很多 ZMW 小孔。ZMW（Zero-Mode Waveguides）孔，即零模波导孔。每一个SMRT Cell 中含有大量这种圆形纳米小孔，直径为50~100nm，该小孔利用了一种物理效应零模波导，外径比激发光波长小，当 DNA 分子进入小孔后，因激发光从孔底发出的光不能穿透小孔进入上方的溶液区，仅被限制在底部一个足以覆盖被检测 DNA 部分的区域，进而收集该区域的信号，将背景噪音降到最低。
在纳米孔底部，锚定着测序模板（DNA 单链）和 DNA 聚合酶，同时包含着四种被不同荧光基团修饰的 dNTP。由于每次添加的 dNTP 所携带的荧光颜色是不同的，在激光的激发下可以发出不同的荧光，根据散射出的荧光信号可以判断添加的碱基类型
HIFI reads
在这种测序模式下，酶读长一般大于插入片段长度，因此酶会绕着模板进行滚环测序，插入片段会被多次测序。单次测序中造成的随机测序错误，可以通过算法进行自我纠错校正，最终得到高准确度的 HiFi reads.
Pacbio优缺点
- pacbio 的优点
1、超长读长
2、准确性高
3、测序速度快
- pacbio 的缺点
1、数据量小，一张芯片目前最多只有 800 万个孔；
2、单分子测序原始数据的错误率高，需要重复测序降低错误率；
3、测序价格较高，SMRT 的成本是二代测序的 6-7 倍；
4、测序仪成本较高，不适合小规模组织购买；
5、提高准确性需要牺牲测序长度和数据量；
总结补充
1·第二代测序是基于PCR发展的高通量测序技术，第一代测序末端终止法，而二代测序使用可逆终止末端，能够实现边合成边测序。
2·特殊标记碱基的荧光信号是确定序列的关键，在测序过程中，必须将单DNA扩增成DNA簇，目的是增强信号。
3·若读取长度太长，基因簇的协同性降低，准确性下降，因此具有高通量，读长短的特点。
4·基因组DNA需要使用鸟枪法打成小片段，测序完成后拼装，而扩增子等小片段可以直接测序。
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