超体RNA分析
标准的RNA seq分析是利用大量组织或者细胞进行的，不能保存空间三维信息和细胞类型，不利于我们理解生物的复杂性。为了能深入研究，大佬们提出了超RNA分析技术，如单细胞测序和空间转录组等。
单细胞测序
scRNA-seq以单个细胞为样本（使用流式细胞仪，需要分离细胞，操作难度大），然后标记扩增其RNA，过程与常规转录组测序相似。单细胞分离后，裂解释放rna进行cDNA的合成，并制备文库。在制备文库过程中，单个细胞的rna用pcr扩增，引入了pcr偏差，可以用UMIs（分子标识符）进行校正。虽然只有少数转录本会被逆转录，但泊松分布法取样限制了检测的灵敏度，能够产生可用数据。
一般单细胞测序时，需要考虑以下问题：
- 是否沿着转录本全长读取？
- 分析更多细胞（广度）还是分析每个细胞更多转录本（深度）？
- 实验成本如何？
单细胞测序的特点：
吞吐量较低，每个细胞都需要独立处理，允许用户选择性剪接和等位基因特异性表达，推断异构体的能力较差，需要从广度和深度两个方向考虑问题。
常用方法：平板或微流控制法（捕获少量细胞，但检测的基因多，形成单个数据集）
未来，单细胞测序可能会像今天转录组测序一样批量使用。。。
空间转录组测序
目前，转录组测序提供了详细的数据，但是无法获取空间信息，这是研究过程中的一大难题。空间组学的两种方法：
空间编码和原位转录组学
空间编码：通过激光捕获显微切割的方法，从组织切片中获取RNA的空间位置编码信息。
原位转录组学：对细胞中RNA进行测序或者成像从而产生组织切片的数据。
目前需要解决的两个问题：
- 该法只能用于新鲜组织
- 分辨率有限制
上述技术不成熟，也有一些替代方法：单分子荧光原位杂交和基于成像法，能够产生更窄的图谱，直接检测RNA，同时提供组织结构和微环境信息。
超稳态RNA分析
DGE分析RNA-seq测量稳定的mRNA水平（通过平衡转录、加工、降解来维持），也可以用于转录和翻译过程和动力学研究。
新生RNA：Nascent RNA，指刚刚转录完成，未经加工运输的RNA。
用新生RNA测量活性转录
基因表达是一个动态过程，DGE在测量复杂快速变化时受到限制，RNA-seq能够用于TSSs图谱和新生RNA定量，从而使rna动力学研究成为可能。新生RNA法特点：半衰期短、丰度低
原生伸长转录测序：native elongating transcription sequencing (NET- seq)，缺乏特异性，可能会污染新生RNA富集。
4-Thiouridine：4-硫代吡啶，真核生物核酸中天然不存在，容易结合，因此可用于初生RNA分析。进行代谢脉冲标记能够识别新生RNA，缺点是：时间长、灵敏度低。
初生RNA的分析方法受到非特异性背景和降解RNA的负面影响，标记比较复杂，限制了灵敏度，进一步的发展可能与空间组学结合，或者RNA-蛋白质互作结合的方法。
核糖体图谱法测定活性翻译
RNA-seq重点关注样品中的mRNA种类和数量，但mRNA不一定直接对应蛋白质的产生。以下两种方法帮助理解“翻译体（从mRNA转化而来的完整蛋白质集合。
- 多核糖体分析法
- 基于RNA-seq的核糖体足迹法
上述两种方式能得知有多少个核糖体占据了一个转录本？以及它们在转录本上的分布。从而推断出特定情况下哪些转录本正在被翻译。
多核糖体图谱：利用离心技术分离多核糖体和单一核糖体结合的mRNA，制备文库，在多核糖体部分检测到更高的丰度，可以推断单mRNA的翻译状态。
Ribo-seq：基于RNA足迹发展而来，使用环六胺抑制翻译伸长，导致核糖体在链上停止，然后用RNase1来消除mRNA，留下20多个受到核糖体保护的核苷酸，受保护的RNA测序揭示核糖体的密度和位置，用于产生文库。通过分析能够识别单个mRNA分子的相对翻译、起始、延伸、终止。
RNA-seq的其他应用
RNA在调节分子互作的生物学过程中发挥重要作用，RNA-seq能够用于解决分子内和分子间RNA的相互作用，揭示结构信息，深入了解转录和翻译过程。
互作分析的共同主题：enrichment of RNA that is interacting relative to RNA that is not.
RNA结构和RNA-蛋白质互作
1.结构化分析：利用核酸酶或试剂探测结构化RNA（双链、dsRNA）和非结构化RNA（单链、ssRNA），核酸酶降解后残余RNA被转化为cDNA并测序，读取深度和反应性呈正比。
PARS:RNA结构并行分析（ parallel analysis of RNA structure）
2.化学作图：特异性修饰核糖核苷酸，标记阻断逆转录过程，导致cDNA截断，在修饰位点引起错掺突变，随后测序推断结构。
3.RRI分析法：RNA-RNA相互作用分析，首先将互作的RNA分子和生物素交联，然后进行富集，链接自由端，片段化之后制备文库，揭示相互作用的位点信息。
4.RNA-protein相互作用分析方法：RNA和蛋白质互作，交联免疫沉淀RNA后进行测序，利用UV紫外光辐射，在RNA和蛋白质间产生共价交联，片段化后，目标蛋白的抗体结合RNA，并链接适配器，提取cDNA，研究结构和互作体。
用分子内RNA互作探索RNA结构
查询RNA结构的方法有两种：核酸酶法和化学探测法
- 核酸酶法 如RNA结构并行分析、片段测序，使用特异酶降解后制备文库，结构化和非结构化区域通过计算识别，但其分辨率低于化学法，同时其尺寸比较大。
- 化学探测法 使用化学探针标记结构化或者非结构化区域，导致逆转录阻断或者cDNA误掺，测序揭示结构特征。探针是小分子，能够在体内确定，更具有生物学意义。还可以用于新生RNA分析和共转录RNA分析。
上述两种方法均产生短RNA片段，只报告单个位点，而误掺和突变检测法每次报告多个位点。所有方法都不是绝对有效，逆转录阻断法可能失败，化学标记可能突变，尖峰控制能提高检测质量却未普及。
这些方法都说明了RNA结构对基因和互作起到的重要作用。
分子间RNA的相互作用
全转录组法和靶向法类似，相互作用的RNAs在体内交联并富集，富集减少进入反应的RNA数量，起到调节作用。
RNA和蛋白质互作
芯片序列是理解RNA和蛋白质互作的关键工具，使用甲醛或者紫外线使RNA和蛋白质交联，再进行简单的RNA免疫沉淀测序得出结果。
该法的两个缺点：
- RNA和蛋白互作的温和洗涤条件下，许多非特异性结合片段也被富集。
- RNA断裂的缺失降低了结合位点的分辨率。
254nm紫外光交联剂介绍：能够在互作位点上产生共价键，并且不会交联蛋白质间互作，稳定了RNA和蛋白质的结合，允许严格富集，破坏天然RNA和蛋白质的互作，减少背景信号。
结论
作者预测RNA-seq将彻底改变真核转录组的分析方式，未来对于基因组的功能理解更加深入，各种分子调控至关重要，因此转录组发展并未结束。
目前，单细胞测序正成为许多实验室标准，空间转录组学也可能逐渐普及。长度测序方法可能取代二代测序技术，成为大多数人的默认方法，为了实现这种情况，需要提高吞吐量并降低错误率，如果长度测序能够像短读测序一样便宜可靠，那将会是未来首选技术！
文献：RNA sequencing: the teenage years，Nature Reviews Gentics，2019【后台回复“20220915”下载PDF】
