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单细胞研究中细胞类型注释是很重要的环节，大致分为人工注释和软件注释。
（1）人工注释需要借助文献检索marker或者结合常用的注释数据库-
cellMarker（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/），
PanglaoDB（https://panglaodb.se/），
CancerSEA（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）等，比较考验研究者的相关背景和精力，优点在于准确性相对较好。
（2）软件自动化注释一般是使用软件内置数据集进行注释，操作相对简单。但是准确性会相对稍差，不过可以作为一种很好的辅助注释手段。
自动化注释的软件很多，本次先简单的分享如何使用singleR进行自动注释。
SingleR是一个用于对单细胞RNA-seq测序（scRNA-seq）数据进行细胞类型自动注释的R包（Aran et al.2019）。依据已知类型标签的细胞样本作为参考数据集，对测试数据集中的细胞进行标记注释。
一 内置数据库
使用SingleR的最简单方法是使用内置参考对细胞进行注释。singleR自带的7个参考数据集，其中5个是人类数据，2个是小鼠的数据：
BlueprintEncodeData Blueprint (Martens and Stunnenberg 2013) and Encode (The ENCODE Project Consortium 2012) （人）
DatabaseImmuneCellExpressionData The Database for Immune Cell Expression(/eQTLs/Epigenomics)(Schmiedel et al. 2018)（人）
HumanPrimaryCellAtlasData the Human Primary Cell Atlas (Mabbott et al. 2013)（人）
MonacoImmuneData, Monaco Immune Cell Data - GSE107011 (Monaco et al. 2019)（人）
NovershternHematopoieticData Novershtern Hematopoietic Cell Data - GSE24759（人）
ImmGenData the murine ImmGen (Heng et al. 2008) （鼠）
MouseRNAseqData a collection of mouse data sets downloaded from GEO (Benayoun et al. 2019).鼠）
二 数据库，R包
2.1 singleR包安装
#if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) # install.packages("BiocManager") BiocManager::install("SingleR") BiocManager::install("Seurat")
2.2 加载数据集，数据
加载数据库，可能会比较慢。建议下载好数据库后进行保存。
library(SingleR) library(celldex) library(Seurat) library(pheatmap) ##下载注释数据库 hpca.se <- HumanPrimaryCellAtlasData() hpca.se #直接load下载好的数据库 load("HumanPrimaryCellAtlas_hpca.se_human.RData") load("BlueprintEncode_bpe.se_human.RData")
2.3 查看seurat结果
使用单细胞工具箱|Seurat官网标准流程得到的pbmc的seurat的结果，
（1）查看seuret聚类结果
load("pbmc_tutorial.RData") pbmc meta=pbmc@meta.data #pbmc的meta文件，包含了seurat的聚类结果 head(meta) orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt percent.HB RNA_snn_res.0.5 seurat_clusters labels AAACATACAACCAC-1 pbmc3k 2419 779 3.0177759 0 0 0 T_cells AAACATTGAGCTAC-1 pbmc3k 4903 1352 3.7935958 0 3 3 B_cell AAACATTGATCAGC-1 pbmc3k 3147 1129 0.8897363 0 2 2 T_cells AAACCGTGCTTCCG-1 pbmc3k 2639 960 1.7430845 0 1 1 Monocyte AAACCGTGTATGCG-1 pbmc3k 980 521 1.2244898 0 6 6 NK_cell AAACGCACTGGTAC-1 pbmc3k 2163 781 1.6643551 0 2 2 T_cells
（2）查看umap和tsne图
plot1 <- DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE) plot2<-DimPlot(pbmc, reduction = "tsne", label = TRUE) plot1 + plot2
三 singleR注释
3.1 singleR使用内置数据集注释
#进行singleR注释 pbmc_for_SingleR <- GetAssayData(pbmc, slot="data") ##获取标准化矩阵 pbmc.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = hpca.se, labels = hpca.se$label.main) # pbmc.hesc #seurat 和 singleR的table表 table(pbmc.hesc$labels,meta$seurat_clusters)
3.2 绘制umap/tsne图
pbmc@meta.data$labels <-pbmc.hesc$labels print(DimPlot(pbmc, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))
3.3 使用多个数据库注释
使用BP和HPCA两个数据库综合注释，使用list函数读入多个数据库
pbmc3 <- pbmc pbmc3.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = list(BP=bpe.se, HPCA=hpca.se), labels = list(bpe.se$label.main, hpca.se$label.main)) table(pbmc3.hesc$labels,meta$seurat_clusters) pbmc3@meta.data$labels <-pbmc3.hesc$labels print(DimPlot(pbmc3, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))
可以看到多了一些hpca没有注视到的细胞类型。
四 注释结果诊断
4.1 基于scores within cells
print(plotScoreHeatmap(pbmc.hesc))
细胞在一个标签的得分很显著的高于其他标签得分，注释结果比较清晰。
4.2 基于 per-cell “deltas”诊断
plotDeltaDistribution(pbmc.hesc, ncol = 3)
Delta值低，说明注释结果不是很明确。
4.3 与cluster结果比较
tab <- table(label = pbmc.hesc$labels,
cluster = meta$seurat_clusters)
pheatmap(log10(tab + 10))
