2021年12月6日，克利夫兰医学中心Lerner研究所方坚松博士（第一作者，现广州中医药大学副研究员）等联合在Nature 子刊Nature Aging上在线发表了题为“Endophenotype-based in silico network medicine discovery combined with insurance record data mining identifies sildenafil as a candidate drug for Alzheimer’s disease”的研究论文。该研究报道了一种基于内表型网络方法的AD药物重定位策略，结合对包含723 万人的保险记录数据库进行回顾性队列分析，发现了老药西地那非（sildenafil）与AD发病风险的降低显著相关(风险比 (HR)= 0.31, 95% 置信区间(CI) 0.25–0.39, P< 1× 10的-8次方)。进一步倾向性评分分层分析发现，西地那非与其它几种药物（地尔硫卓、格列美脲、氯沙坦和二甲双胍）相比，同样可显著降低AD发病风险。研究还发现，在AD病人来源的多功能干细胞分化的神经元模型中，西地那非可显著增加神经突生长并降低磷酸化Tau蛋白表达，从机制上进一步支持了其对 AD 的潜在应用价值。总之，该研究证明了内表型网络结合临床电子病历挖掘可作为一种有效促进AD药物开发的策略，同时可应用于其它神经退行性疾病的药物发现。
1.研究背景
阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD），俗称“老年痴呆症”， 是一种严重的神经退行性疾病，主要临床特征表现为记忆力减退、思维迟缓以及性格和行为的改变。目前，全球约有5000万AD患者，且随着全球老年化的加剧，其患病率也在不断上升，预计到2050年，阿尔兹海默症患者将增加至1.5亿以上。令人遗憾的是，AD的病因复杂，科学界至今仍未破译阿尔兹海默症发病的具体机制，至今也仍未有真正逆转AD进程的药物上市。近十年来，随着药物重定位在新药研发中迸发出了巨大潜力，科学家们开始关注于通过老药新药途径开发抗AD药物, 据统计目前已有近30多个FDA已上市的药物正在做AD相关的临床试验。
AD发病机制复杂，主流观点认为病因是β-淀粉样蛋白（Aβ）和Tau蛋白沉积造成的神经元大量死亡。即Aβ形成斑块，tau蛋白形成神经纤维缠结，共同危害神经元健康。然而，数十年来靶向这两个靶点的AD药物临床试验却鲜有成功。目前越来越多的临床与实验表明，AD的诱发主要来自于Aβ和tau的相互作用，而非单纯Aβ或tau引起，即Aβ和tau存在协同作用（Nat Neurosci. 2020;23:1183-93; Alzheimers Dement. 2017;13, 644–53；Cell Rep. 2019;29, 3592–604）。内表型网络是一类能够表征某一独立生物体系功能中间遗传特征的分子网络，可进一步发展为多种遗传学相关的疾病。此前方坚松博士等受邀药学顶级期刊 Medicinal Research Reviews 杂志（第一作者），发表了题为“Harnessing endophenotypes and network medicine for Alzheimer's drug repurposing”的前沿综述，提出了基于网络医学框架的AD内表型网络假说（Med Res Rev. 2020 ;40(6):2386-2426）。该假说认为复杂性疾病AD涉及多种病理机制，每一种病理机制可以抽象为一种内表型（Endophenotype），而这些表型可以同时参与多种疾病的发病机制。
在此篇Nature Aging研究中，作者们旨在运用先前提出的内表型网络方法开展抗AD的药物重定位研究，并结合大规模的临床电子病历数据挖掘评估候选药物与AD疾病风险之间的关联性，同时结合体外AD细胞模型研究其作用机理（图1）。
图1 基于内表型网络方法的抗AD药物重定位策略
2.主要发现
研究团队首先通过整合144个高质量的AD种子基因用于构建Aβ与Tau互作内表型网络（图2），并使用最大连接子图LCC方法证明该网络具有显著的模块特征。接着证明了与单独靶向Aβ与Tau的药物相比，同时靶向Aβ与Tau蛋白的AD在研药物与多组学来源的AD疾病模型具有更为显著的AD网络近邻特征，即表现出与AD更好的病理相关性。基于此他们构建并论证了Aβ与Tau互作内表型网络能够很好的拟合AD的病理特征，并采用该网络模型预测了美国FDA的1608个已上市药物，发现了66个潜在的抗AD药物。
图2 Aβ与Tau互作内表型网络
进一步的分析发现老药西地那非为最优的候选药物，已报道的文献证据表明了西地那非能够显著改善多个AD转基因动物模型（APP/PS1和J20）小鼠的学习记忆能力（Br. J.Pharmacol. 2011; 164, 2029–2041; Neuropharmacology. 2013; 64, 114–123），同时也有两项小规模临床试验初步显示西地那非可能对治疗 AD 具有潜在益处（J. Alzheimers Dis. 2019;70, 163–170；J. Alzheimers Dis. 2017;60, 1351–1364）。然而，目前未见大规模回顾性队列研究显示其与降低AD风险相关。
基于此，该团队利用MarketScan Medicare Claims数据库中2012 年至 2017 年的保险记录数据（包含732万人的临床电子信息）系统研究了西地那非服用人群与AD发病风险之间的关系。为了尽量降低混杂因素，共进行了三类基于药物队列的观察性研究：1) 西地那非服用者 vs.非西地那非服用者，2) 西地那非 vs.对照药物（地尔硫卓或格列美脲，未见AD相关的临床证据），以及 3) 西地那非与对照药物（氯沙坦或二甲双胍，已开展过抗AD临床试验）。对于每个队列比较，首先对数据进行了倾向评分分层（n = 10），并完成了分层前后的 Kaplan-Meier 曲线及其对数秩检验，以及 Cox 回归分析。结果表明，这五个药物流行病学分析揭示了服用西地那非对降低 AD 风险具有显著益处。紧接着，进一步地考虑疾病（常见并发症冠心病、高血压及二型糖尿病）因素、性别因素及年龄因素校正后，进一步揭示了服用西地那非对降低男性患AD风险显著相关。尽管如此，未来仍需要进一步设计随机对照临床试验去证实西地那非与AD之间的因果关系。
为了进一步研究西地那非抗AD的分子机制，研究团队利用网络分析预测出西地那非抗AD的作用机制与影响Tau功能相关的蛋白（GSK3β与CDK5）有关，并在脂多糖刺激的人源小胶质细胞HMC3细胞模型上进行验证，发现了西地那非（30 和 100 μM）预处理能够降低GSK3β和 CDK5的磷酸化水平。同时在AD病人来源的多功能干细胞分化的神经元模型中，西地那非可显著减少了 分化的神经元中 p-tau 181 的积累。
3.总结
本研究提供了一种基于网络的药物重定位综合方法，该方法结合了内表型网络发现、大规模AD患者数据分析，以及体外分子机制探讨，发现了具有降低AD发病风险的抗AD有效候选药物西地那非。该方法同样可用于研究用其它AD相关的内表型，如炎症和代谢功能障碍，同时也适用于其它神经退行性疾病。该研究还发现了除老药西地那非以外的其它众多潜在抗AD药物，未来将开展更多的临床前或临床研究去进一步发现它们的潜在应用价值。
