今天继续分享" eQTLs play critical roles in regulating gene expression and identifying key regulators in rice "这篇文献的阅读笔记，如果你也对这篇文章感兴趣，可以一起交流学习，这里是第二部分研究结果（第一部分摘要介绍请点击这里直接跳转阅读第一部分）
研究结果
根据基因组和转录组解释表型变异
作者对287份材料淀粉含量进行了测定，利用GWAS方法鉴定了25个与淀粉含量相关的关键基因座。
随后进行TWAS分析，结合转录组表达数据和表型数据，筛选检测到21个与淀粉含量显著相关的候选基因。
作者使用fusion软件检测基因表达与表型之间的相关性，并使用coloc软件确定eQTLs与GWAS结果之间的共定位，fusion软件检测到了338个与表型显著相关的候选基因，其中有120个也被coloc软件检测到。
近端eQTL热点L01和GWAS的LS01很接近，并且由上图可知eQTL共调控基因簇2中有4个与GWAS的结果重叠，作者发现有一个SNP在eQTL和GWAS结果中都具有显著影响，推测其可能控制相关物质的合成基因，影响水稻的淀粉含量。
鉴定远端eQTL热点及调控因子
作者对全基因组中鉴定出的远端eQTL进行分析，得出96个远端eQTL热点，涉及到1726个基因的调控。
如上图所示，chr01染色体上发现了一个远端eQTL热点，它与32个下游基因有关。通过GO富集分析，这些基因在脂代谢途径中富集，进一步分析发现在二萜类抗毒素的合成中发挥重要作用。
通过对刚刚提到的eQTL热点区域的基因和32个下游基因进行共表达分析，结果表明：与合成二萜类抗毒素相关的所有基因均共表达并聚类在红色部分，热点区有一个转录因子BHLH026也位于该区域，作者认为这个转录因子可以调节二萜类抗毒素相关多个下游基因的表达。
为了验证转录因子是否通过影响自身eQTL调节自身的表达，从而影响下游基因的表达，作者进一步对该转录因子进行eQTL分析。
结果表明：该转录因子有三个互不连锁的近端eQTLs（如上图），其中位于BHLH026上游的一个SNP：VG1015145775与下游脂代谢相关基因的远端eQTL的SNP紧密连锁，下游基因远端eQTL的SNPs在BHLH026近端eQTL中也达到显著水平，并与VG1015145775紧密连锁。因此，作者推测VG1015145775连锁区的变异可能会影响热点主调控蛋白的表达，进而影响其下游基因的表达。
随后，作者对BHLH026进行单倍型分析，最终将BHLH026分为四个主要单倍型（如上图e所示），HAP2和HAP3两种单倍型主要分布在籼型和AUS中，而HAP1和HAP4两种单倍型仅分布在粳型中。
在籼型和AUS的HAP2和HAP3单倍型之间，下游基因的表达没有显著差异。
BHLH026激活下游基因表达
为了证实BHLH026（名字太长，之后简称它为B6）对下游基因的调控作用，作者进行了酵母单杂实验。结果表明B6能够与启动子区域结合，然后进行双荧光素酶活性测定，发现B6具有转录激活活性。
利用CPS2和KSL6启动子序列和B6蛋白进行双荧光素酶活性测定，也表明B6蛋白能与下游基因的启动子区结合并激活其表达。
B6对抗毒素合成和抗病性影响
作者利用CRISPR-cas9技术构建了一个B6功能缺失突变体，并在B6的第三外显子设计了两个gRNA靶位点。转化后，得到两个转基因株系发生突变功能丧失。
之后，利用ORF构建了B6过表达株系，通过RT-qPCR实验发现，前者中表达量降低，后这种表达量升高，因此，B6是调控二萜类物质合成的关键转录因子。
为了研究转基因株系中该化合物的代谢情况，作者采用液相色谱-质谱联合技术对化学物质进行分析：
检测了二萜类抗毒素及其中间体，结果表明，过表达系的上述代谢产物含量均显著高于野生型；然而，转基因系几乎没有变化。此外，还在另外一个途径中检测到了二萜类抗毒素植物木质素等，这些代谢产物在过表达系中的水平显著高于野生型，而在转基因系中水平显著下降。
此外，作者还利用RT-PCR技术检测了水稻中二萜抗毒素合成相关基因的表达。与代谢组分析结果相似，这些基因在过表达系中的表达量均显著升高，在缺失转基因突变体中显著降低。
综上所述，B6确实是合成抗毒素的关键转录因子。
作者用菌株接种了B6转基因材料。对各转基因材料的感病性进行了测定，发现B6缺失突变体的病斑长度比野生型长，说明其更易感。相反，B6过表达品系的抗性增强，再次证明研究结果正确。
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