引言

HR-DDR（同源重组、DNA 损伤反应及修复）通路中多个关键组分的遗传改变，已被证实与遗传性癌症综合征密切相关。除了BRCA1/2、ATM和PALB2等常见的致病基因外，其他HR-DDR通路基因的突变也可能导致胰腺导管腺癌（PDAC）出现HR-DDR缺陷。

研究团队聚焦于包含15个基因的HR-DDR检测Panel，利用全外显子测序（WES）和全基因组测序（WGS）技术，深入鉴定并表征了PDAC样本中的遗传变异。在生信分析环节，团队采用Sentieon Haplotyper算法精准检测SNP和INDEL。

研究结果显示，不同HR-DDR基因的突变状态与同源重组缺陷（HRD）评分的高低存在显著关联。在50例PDAC患者中，研究团队鉴定出8例肿瘤携带至少一个HR-DDR基因突变。其中，携带BRCA2突变的肿瘤表现出较高的HRD评分，而携带CHEK2突变的肿瘤 HRD评分则为零。值得关注的是，本研究中有4例PDAC患者携带RAD51B基因突变，且均为胚系突变。但目前的胚系基因检测Panel尚未涵盖RAD51B。

本周Sentieon文献解读专栏为大家推荐一篇发表于2022年JCO Precision Oncology 的佳作——《RAD51B Harbors Germline Mutations Associated With Pancreatic Ductal Adenocarcinoma》。该研究由深圳华大基因（BGI）与美国约翰·霍普金斯大学（JHU）等机构合作完成。

我们特此对该文进行解读，希望能为从事肿瘤遗传学及精准医学研究的同仁提供有价值的参考。

材料与方法学

研究对象与基因Panel

HR-DDR基因Panel：研究针对HR-DDR通路的伴随诊断15基因Panel展开分析，具体包括：BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D 和 RAD54L。

患者队列：研究人员从胰腺癌精准医学卓越中心登记数据库中，纳入了50例连续入组的 PDAC患者。这些患者均在2016年3月至2018年2月期间接受治疗。

研究方法

DNA提取、文库制备和测序

研究团队提取基因组DNA后，针对DNA足量的样本，同时构建了WES和WGS文库。所有文库均在DIPSEQ平台上进行测序。其中，WES在正常样本和肿瘤样本中的平均覆盖度分别达到268×和665×；WGS在正常样本和肿瘤样本中的平均覆盖度分别达到46×和49×。

数据分析

原始测序数据经SOAPnuke过滤后，高质量数据导入Sentieon分析流程。该流程严格遵循GATK最佳实践，基于UCSC人类参考基因组（hg19）高效完成比对与数据处理。

在胚系变异检测环节中，研究团队针对有PDAC家族史的患者，使用Sentieon Haplotyper 算法在WES数据中精准鉴定SNP和Indel，随后利用GATK模块完成变异过滤。

图1 Sentieon的作用

在体细胞变异检测环节中，利用WES和WGS数据检测体细胞层面的SNP和Indel。为确保结果的准确性，采用了多软件交叉验证的策略：SNV：整合Mutect2、Strelka2、Lancet、Muse 和SomaticSniper的检测结果；Indel：整合Strelka2、Lancet、Mutect2和Svaba的检测结果； 高可信变异：定义为至少被两个变异软件（或算法）共同检出的位点。

为排除潜在的胚系变异干扰，研究团队设定了严格的过滤标准：

（1）基于数据库与测序深度的过滤：

针对dbSNP收录的变异：若在配对正常样本中支持Reads数＜19条，或者未被COSMIC数据库收录，则予以排除；
针对未收录于dbSNP的变异：若正常样本中的支持Reads数＜8条，予以排除。
（2）基于人群频率的过滤：排除在千人基因组计划和ExAC数据库中次等位基因频率（MAF）>0.1% 的变异，但ClinVar注释为“致病性”的变异除外。

其他变异类型方面，研究使用FACETS鉴定WES和WGS数据中的拷贝数变异（CNV），并利用Manta检测WGS数据中的结构变异（SV）。

变异的临床意义分类

研究团队将检测到的SNV和Indel按临床意义划分为四类：

（1）临床显著性变异：在ClinVar数据库中被注释为“致病”或“可能致病”的变异；

（2）潜在临床显著性a：在ClinVar中被注释为“意义未明（VUS）”或未被收录的截断突变（包括无义突变、移码突变或涉及 ±1/2 剪接位点的突变）；

（3）潜在临床显著性b：在ClinVar中被注释为VUS或未被收录，且经生信软件预测为有害的变异。具体标准为：

• 错义突变：经MetaSVM、MetalLR和FATHMM-MKL三种算法中任意一种预测为有害；
• Indel：经SIFT算法预测为有害。
  （4）非临床显著性变异：在ClinVar中被注释为“良性”或“可能良性”的变异。

同源重组缺陷评分

研究采用scarHRD R包计算HRD评分。该算法基于基因组瘢痕特征，通过整合肿瘤倍性、纯度及等位基因特异性拷贝数图谱进行量化。此外，对于WGS数据，研究团队还额外引入了CHORD分类器进行辅助评估。

肿瘤突变负荷与新抗原预测

• TMB计算：TMB定义为编码区内非同义SNV和Indel的总数除以编码区的大小（以Mb为单位）。
• 新抗原预测：首先使用OptiType进行HLA等位基因分型。随后，基于结合亲和力筛选新抗原，筛选标准为：经至少一种算法预测结合亲和力<500nM。
• 新抗原负荷：最终估算为能与HLA-A等位基因结合的多肽数量。

研究结果

研究团队对8例有家族史的PDAC患者进行了详细的分析，患者平均年龄为67岁。共鉴定出12个HR-DDR基因变异，其中1 例患者携带3个变异，2例患者携带2个变异，其余5例各携带1个变异。基因变异中错义突变占大多数（9个）；预测均会导致蛋白提前截断，从而引起BRCA2和RAD51B功能丧失的移码突变共2个；无义突变占1个。

值得注意的是，1例患者携带BRCA2的体细胞突变，其VAF仅为0.06。基因变异频率分析显示RAD51B突变频率最高（n=4，占50%），其次是BRIP1和RAD54L。RAD51B表现出的高频率胚系变异特征，强烈提示该基因可能在家族性PDAC的易感性中发挥着关键的作用。

图2 胰腺导管腺癌中HR-DDR通路基因的变异统计

研究团队利用WGS数据对5例PDAC患者进行了结构变异评估。结果显示，携带3个HR-DDR基因变异的患者1检出的SV数量最高，其次是携带2个变异的患者2。这一趋势表明多重HR-DDR基因变异的叠加可能导致更显著的基因组不稳定性。

进一步分析发现，在患者1中鉴定出一个涉及RAD51B的染色体易位。该易位的断点位于RAD51B基因的内含子10，导致基因结构被破坏及蛋白截断，从而丧失了正常的DNA修复功能。

图3 携带HR-DDR基因变异的PDAC肿瘤中的结构变异（SV）统计

图4 基于WGS数据鉴定出的RAD51B易位结构变异;该图展示了易位发生的位置、融合伴侣、方向及断点连接片段。断点1：位于16号染色体（chr16:64133026），距CDH11基因844,631 bp。断点 2：位于14号染色体（chr14:68943896），坐落于RAD51B基因的内含子10中。 后果预测：该变异预计会导致RAD51B蛋白在第346位氨基酸（丙氨酸）处发生截断。 说明：14号和16号染色体上的断点连接片段分别以蓝色和粉色标记 。

在基于WES数据的情况下，检测出8例患者的HRD评分中位数为21.3。其中，携带2个临床显著性BRCA2变异的患者7评分最高，而携带1个临床显著性CHEK2变异的患者5评分最低。这一显著差异表明，并非所有HR-DDR基因变异都会导致同等的HRD状态。

在基于WGS数据的情况下，研究进一步对5例样本进行了scarHRD和CHORD算法评估。结果显示，scarHRD评分中位数为22，而CHORD评分中位数仅为0。携带 RAD51B变异的患者3获得了最高的scarHRD评分，进一步支持了RAD51B功能缺失会导致显著同源重组修复缺陷的观点。携带BRIP1变异的患者4虽然获得了最高的 CHORD评分，但整体队列的低评分提示，由CHORD算法定义的HRD表型在该 PDAC队列中并不普遍。

图5 HR-DDR基因变异对应的HRD评分及免疫特征

在免疫相关指标方面，研究团队评估了患者的新抗原负荷和肿瘤突变负荷（TMB），结果显示，整体队列的平均TMB为1.34。

研究发现携带RAD51B移码突变的患者3展现出最高的新抗原水平和TMB值。相反，携带CHEK2变异的患者5则未预测到新抗原，且TMB最低。这与其HRD评分为零的特征高度一致，提示该样本的基因组不稳定性最低。值得特别关注的是，4例携带RAD51B变异的肿瘤样本显示出相对较高的免疫原性，其平均新抗原负荷为62.3，平均TMB为1.75。

图6 携带HR-DDR基因变异的PDAC肿瘤的新抗原负荷与肿瘤突变负荷（TMB）

研究讨论

基因-表型相关性

综合分析显示，BRCA2突变与高HRD评分呈显著正相关，而CHEK2突变则与零HRD评分相关。不同的HR-DDR基因突变对应的HRD评分存在差异，这提示不同基因突变携带者对PARP抑制剂的治疗敏感性可能存在异质性。

免疫特征

研究发现，HR-DDR 缺陷型PDAC的TMB和新抗原负荷显著低于高TMB或微卫星高度不稳定的肿瘤。这一特征表明，HR-DDR缺陷本身并不会导致错义突变率的显著升高，因此推测此类患者对单药免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗响应可能不佳。

RAD51B的重要发现

在8例携带HR-DDR 变异的患者中，有4例携带RAD51B变异，且均为胚系突变。作为RAD51蛋白家族的重要成员，RAD51B在DNA同源重组修复中发挥关键作用。鉴于目前常规的胚系基因检测Panel尚未覆盖RAD51B，该研究的发现支持将其纳入HR-DDR通路的胚系检测范围内。

研究局限性

研究受限于较小的样本量且为描述性研究的性质，结果的适用性会受到一定影响。未来需开展更大规模的研究队列，以进一步验证上述发现。

研究总结

该研究发现RAD51B在PDAC中具有较高的胚系突变频率，但在当前的临床遗传学检测Panel中往往未被涵盖。因此，研究结果强烈支持将其纳入HR-DDR通路基因的胚系检测Panel中，从而识别出更多可能从靶向治疗中获益的PDAC患者。