一次简化基因组数据分析实战

尽管目前已经有大量物种基因组释放出来，但还是存在许多物种是没有参考基因组。使用基于酶切的二代测序技术，如RAD-seq，GBS，构建遗传图谱是研究无参考物种比较常用的方法。Stacks就是目前比较通用的分析流程，能用来构建遗传图谱，处理群体遗传学，构建进化发育树。

这篇教程主要介绍如何使用Stacks分析基于酶切的二代测序结果，比如说等RAD-seq，分析步骤为环境准备，原始数据质量评估， 多标记数据分离，序列比对（无参则需要进行contig de novo 组装），RAD位点组装和基因分型，以及后续的标记过滤和格式转换。

适用范围：

• 酶切文库类型：ddRAD, GBS, ezRAD, quad-dRAD和Rapture。 但是stacks更适用于RAD-seq，GBS推荐TASSEL。如下是“Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing”对几种常见的建库方法的总结

• 测序类型： 双酶切文库双端测序数据或单端数据
• 测序平台： illumina， IonTorren

局限性：

• 不能用于普通的随机文库测序
• 不能适用单酶切文库的双端测序数据（stacks 2.0可以）
• 无法用于混池测序，也不适合与多倍体，因为stacks在组装时假定物种为二倍体
• 对于深度不够，且错误率比较高的数据，它也没辙，所以建议深度在20x以上

分析者要求：掌握基本的Unix命令行，会基本集群操作，熟悉R语言编程。

硬件要求：电脑的内存在64G以上，8～16核CPU起步，准备1T以上的硬盘。

前期准备

准备分为两个部分：软件安装和数据下载。

数据准备： 数据来自于2012年发表的"The population structure and recent colonization history of Oregon threespine stickleback determined using restriction-site associated DNA-sequencing"中的三刺鱼( Gasterosteus aculeatus )数据集，一共有78个样本，来自于美国俄勒冈海岸的4个群体，两个是海水鱼（Cushman Slough’ (CS)和 ‘South Jetty’ (SJ)），两个是淡水鱼（‘Winchester Creek’ (WC) 和 ‘Pony Creek Reservoir’ (PCR)）。

mkdir -p stacks-exercise
cd stacks-exercise
wget -q http://catchenlab.life.illinois.edu/data/rochette2017_gac_or.tar.gz &
tar xf http://catchenlab.life.illinois.edu/data/rochette2017_gac_or.tar.gz

这个数据大约在9G左右，因此需要很长一段时间，这段时间可以安装软件。

软件安装：需要安装BWA, SAMtools, stacks,R/ADEgenet. 好消息是这些软件都可以通过bioconda进行安装，除了R/ADEgenet推荐直接用R的install.packages("adegenet")

# 适用conda安装软件
conda install -c bioconda bwa
conda install -c bioconda samtools
conda install -c bioconda stacks=1.47

估计此时数据依旧没有下载完，我们先创建后续需要用到的文件目录

mkdir -p stacks-exercise/{00-raw-data,01-clean-data,02-read-alignment,reference/genome,03-stacks-analysis/{de-novo,ref-based},test/{de-novo,ref-based},info}
# 目录结构
stacks-exercise/
|-- 00-raw-data # 原始数据
|-- 01-clean-data # 处理后数据
|-- 02-read-alignment # 比对后数据
|-- 03-stacks-analysis # 实际运行
|   |-- de-novo
|   |-- ref-based
|-- info # barcode信息
|-- reference # 参考基因组
|   |-- genome
|-- rochette2017_gac_or.tar.gz
|-- test # 测试数据集
    |-- de-novo
    |-- ref-based

准备输入文件（可选）

这一步并非必须，取决公司提供给你什么样的数据。对于多个样本测序，公司可能返还的是含有barcode信息原始lane数据，那么就需要从原始数据中将各个样本的数据区分开。

先将解压得到的三个lane的原始数据移动到我们的文件夹中，

cd stacks-exercise
mv rochette2017_gac_or/top/raw/{lane1,lane2,lane3} 00-raw-data

接着准备两个制表符（Tab）分隔的文件，用于将barcode和样本对应，以及样本和群体一一对应。这里不需要自己写了，只需要将作者存放info里的tsv文件复制过来即可，格式如下

mv rochette2017_gac_or/top/info/*.tsv info/
# barcode和样本的对应关系
head -n3 info/barcodes.lane1.tsv
CTCGCC  sj_1819.35
GACTCT  sj_1819.31
GAGAGA  sj_1819.32
# 样本和群体的对应关系
head -n3 info/popmap.tsv
cs_1335.01  cs
cs_1335.02  cs
cs_1335.03  cs

关barcode和样本的tsv中，样本的命名里不要包含空格，只能用字母，数字，".",“-”和"_", 而且有意义，最好包含原来群体名的缩写和样本编号。

可视化评估测序数据

思考并记录下按照你的实验处理，你得到的read大概会是什么结构，从理论上讲，从左往右应该分别是：barcode，限制性酶切位点和后续的测序碱基。比如说案例应该现有6个碱基的barcode，SbfI限制性位点CCTGCAGG和其余的DNA序列，总计101bp

<6-nt barcode>TGCAGG<unique 89-nt sequence>

然后我们就可以用Linux自带的文本处理命令检查一下，比如说grep/zgrep，zcat+head, less/zless.

如果序列已经去掉了barcode，那么开头的就会是酶切位点。

第一步：数据预处理

这一步会用到process_radtags, 它扶负责对原始的数据进行处理，包括样本分离，质量控制，检查酶切位点完整性等。

# 在项目根目录下
raw_dir=00-raw-data/lane1
barcodes_file=info/barcodes.lane1.tsv
process_radtags -p $raw_dir -b $barcode_file \
    -o 01-clean-data/ -e sbfI --inline_null \
    -c -q -r &> 01-clean-data/process_radtags.lane1.oe &

解释下参数，虽然大部分已经很明了： -p为原始数据存放文件夹，-b为barcode和样本对应关系的文件，-o为输出文件夹， -e为建库所用的限制性内切酶，--inline_null表示barcode的位置在单端的read中，-c表示数据清洗时去除表示为N的碱基， -q表示数据清理时要去除低质量碱基 -r表示要抢救下barcode和RAD-tag。

这一步需要留意自己的单端测序，还是双端测序，barcode是在read中，还是在FASTQ的header中，是否还需要去接头序列，是否是双酶切建库等。
另外这一步比较耗时，尽量脱机运行或者提交到计算节点中，不然突然断网导致运行终止就更浪费时间了。
将运行结果记录到日志文件中，方便后期检查报错。

运行结束后，在01-clean-data下会有除了process_radtags.lane1.oe外，还会有process_radtags.lane1.log，前者记录每条lane的数据保留情况，后者记录每个样本的数据保留情况。可以将后者复制到Excel表格中，用柱状图等方法直观了解

从图中可以发现,"sj_1483.05"和"sj_1819.31"几乎没有read留下来，这能是建库上导致的问题，我们需要将其fastq文件直接删掉，从“info/popmap.tsv”中删掉或者用“#”注释掉它对应行（推荐后者）。

在数据预处理这一步，stacks还提供process_shortreads，clone_filter， kmer_filter用于处理cDNA文库和随机切割的DNA文库，如果是RAD-seq不需要用到。

如果是双端测序，stacks1.47只能通过cat合并两个数据，而不能有效的利用双端测序提供的fragment信息。stacks似乎可以，我之后尝试。

第二步：获取样本变异数据

这一步之后，分析流程就要根据是否有参考基因组分别进行分析。无参考基因组需要先有一步的 de novo 组装，产生能用于比对的contig。有参考基因组则需要考虑基因组的质量，如果质量太差，则需要进一步以无参分析作为补充。

参考基因组主要用于区分出假阳性的SNP，将snp与附近其他共线性的snp比较来找出离异值，这些离异值大多是因为建库过程所引入的误差，如PCR的链偏好性扩增。

无论是何者，我们一开始都只能用其中的部分数据进行参数测试，根据不同的参数结果作为反馈，进行调优，这一步根据你的运气和经验，还有你的算力，时间不定。毕竟超算一天，普算一年。

有参考基因组

三刺鱼是可从ensemblgenomic上搜索到到参考基因组信息

• http://asia.ensembl.org/Gasterosteus_aculeatus/Info/Index

但是质量非常一般，仅仅是contig程度，只能说是凑合使用了。

建立索引数据库

stacks不直接参与比对，而是处理不同比对软件得到的BAM文件，因此你可以根据自己的喜好选择比较工具。目前，基因组比对工具都是首选BWA-mem，所以这里建立bwa的索引

# 位于项目根目录下
cd reference/genome
wget -q ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/gasterosteus_aculeatus/dna/Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa.gz
gzip -d Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa.gz
cd ..
mkdir -p index/bwa/
genome_fa=genome/Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa
bwa index -p index/bwa/gac $genome_fa &> index/bwa/bwa_index.oe
# 结果如下
|-- genome
|   |-- Gasterosteus_aculeatus.BROADS1.dna.toplevel.fa
|-- index
    |-- bwa
        |-- bwa_index.oe
        |-- gac.amb
        |-- gac.ann
        |-- gac.bwt
        |-- gac.pac
        |-- gac.sa

小样本参数调优

这一步是为了调整比对工具处理序列相似性的参数，保证有绝大多数的read都能回帖到参考基因组上，因此参数不能太严格，能容忍遗传变异和测序误差，也不能太宽松，要区分旁系同源位点。对于BWA-MEM而言，几个和打分相关的参数值得注意:

• -B: 不匹配的惩罚, 影响错配数，默认是4
• -O: 缺失和插入的gap打开的惩罚，影响InDel的数目，默认是[6,6]
• -E: gap延伸的惩罚，长度k的gap惩罚为'{-O} + {-E}*k'， 默认是[1,1]
• -L: soft clip的惩罚，也就是read两端直接切掉碱基来保证匹配，默认是[5,5]

对于参考基因组质量比较高，且研究物种和参考基因组比较近，那么参数调整没有太大必要性。如果质量不要，或者所研究物种和参考基因组有点距离，那么就需要注意不同参数对结果的影响，必要时使用IGV人工检查。

让我们先以默认参数开始，处理其中一个样本

# 位于项目根目录下
# 在测试文件下按照参数创建文件夹
mkdir -p stacks-test/ref-based/{alignment-bwa,stacks-bwa}
## bwa-mem比对
sample=cs_1335.01
fq_file=01-clean-data/$sample.fq.gz
bam_file=test/ref-based/alignment-bwa/${sample}_default.bam
bwa_index=reference/index/bwa/gac
bwa mem -M $bwa_index $fq_file | samtools view -b > $bam_file &

这里的bwa mem使用了-M参数，通常的解释这个参数是为了和后续的Picard标记重复和GATK找变异兼容。

进一步的解释，不用-M,split read会被标记为SUPPLEMENTARY, 使用该选项则是标记为SECONDARY（次要），即不是PRIMARY（主要），既然不是主要比对，所以就被一些工具忽略掉。如果是SUPPLEMENTARY就有可能在标记重复时被考虑进去。其中split read是嵌合比对的一部分，具体概念见SAM格式解释。

对于比对结果，可以用samtools stats和samtools flagstat查看一下质量

samtools flagstat test/ref-based/alignment-bwa-default/cs_1335.01_default.bam
#1310139 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
#7972 + 0 secondary
#0 + 0 supplementary
#0 + 0 duplicates
#1271894 + 0 mapped (97.08% : N/A)

97.08%的比对率应该是很不错了，不过可以尝试降低下错配和gap的惩罚，看看效果

# 位于项目根目录下
sample=cs_1335.01
fq_file=01-clean-data/$sample.fq.gz
bam_file=test/ref-based/alignment-bwa/${sample}_B3_O55.bam
bwa_index=reference/index/bwa/gac
bwa mem -M -B 3 -O 5,5 $bwa_index $fq_file | samtools view -b > $bam_file &
samtools flagstat test/ref-based/alignment-bwa-default/cs_1335.01_default.bam
#1309830 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
#7663 + 0 secondary
#0 + 0 supplementary
#0 + 0 duplicates
#1272297 + 0 mapped (97.13% : N/A)

也就提高了0.05%，所以就用默认参数好了。通过IGV可视化，可以了解简化基因组的read分布是比较稀疏，10k中可能就只有2个。

得到的BAM文件使用pstack中找snp，

# 位于项目根目录下
sample=cs_1335.01
sample_index=1
bam_file=test/ref-based/alignment-bwa/${sample}_B3_O55.bam
log_file=test/ref-based/stacks-bwa/$sample.pstacks.oe
pstacks -t bam -f $bam_file -i $sample_index -o test/ref-based/stacks-bwa/ &> $log_file

这里的参数也很简单，-t用来确定输入文件的格式,-f是输入文件,-i对样本编序，-o指定输出文件夹。除了以上几个参数外，还可用-p指定线程数，-m来制定最低的覆盖度，默认是3.还可以用--model_type [type]制定模型。

最后得到$sample.tags.tsv.gz, $sample.models.tsv.gz, $sample.snps.tsv.gz, 和 $sample.alleles.tsv.gz共4个文件，以及一个日志文件。参数评估的主要看日志文件里的几个指标：

• 实际使用的alignment数
• 因soft-clipping剔除的alignment数，过高的话要对比对参数进行调整
• 每个位点的平均覆盖度，过低会影响snp的准确性。

这里仅仅用了一个样本做测试，实际上要用10个以上样本做测试，看平均表现，

全数据集处理

在使用小样本调试完参数，这部分参数就可以应用所有的样本。除了比对和使用pstacks外，还需要用到cstacks根据位置信息进一步合并成包含所有位点信息的目录文件，之后用sstacks从cstacks创建的目录文件搜索每个样本的位点信息。代码为

cstacks -p 10 --aligned -P 03-stacks-analysis/ref-based -M info/popmap.tsv
# 以其中一个样本为例
sample=cs_1335.01
log_file=$sample.sstacks.oe
sstacks --aligned -c 03-stacks-analysis/ref-based/batch_1 -s 03-stacks-analysis/ref-based/$sample -o 03-stacks-analysis/ref-based/ &> 03-stacks-analysis/ref-based/$log_file

你可以写一个shell脚本处理，不过我现在偏好用snakemake写流程，代码见最后。

无参考基因组

基于参考基因组的分析不能体现出RAD-seq的优势，RAD-seq的优势体现在没有参考基因组时他能够提供大量可靠的分子标记，从而构建出遗传图谱，既可以用于基因定位，也可以辅助组装。

和全基因组随机文库不同，RAD-seq是用限制性内切酶对基因组的特定位置进行切割。这样的优点在于降低了 de novo 组装的压力，原本是根据overlap（重叠）来延伸150bp左右短读序列，形成较大的contig，而现在只是将相似性的序列堆叠(stack)起来。这样会产生两种分子标记：1）由于变异导致的酶切位点出现有或无的差异；2）同一个酶切位点150bp附近存在snp。

参数调优

这一步使用的核心工具是ustacks和cstacks,前者根据序列相似性找出变异，后者将变异汇总，同样需要使用小样本调整三个参数-M,-n,-m。 ustacks的 M 控制两个不同样本等位基因（allele）之间的错配数，m 控制最少需要几个相同的碱基来形成一个堆叠（stack).最后一个比较复杂的参数是能否允许gap(--gap)。而cstacks的 n 和 ustacks的 M等价。

因此，我们可以尝试在保证 m=3的前提，让M=n从1到9递增，直到找到能让80%的样本都有多态性RAD位点，简称r80. Stacks提供了denovo_map.pl来完成这部分工作，下面开始代码部分。

首先是从info/popmap.tsv中挑选10多个样本用于参数调试

cat popmap_sample.tsv

cs_1335.01  cs
cs_1335.02  cs
cs_1335.19  cs
pcr_1193.00 pcr
pcr_1193.01 pcr
pcr_1193.02 pcr
pcr_1213.02 pcr
sj_1483.01  sj
sj_1483.02  sj
sj_1483.03  sj
wc_1218.04  wc
wc_1218.05  wc
wc_1218.06  wc
wc_1219.01  wc

然后为每个参数都准备一个文件夹

mkdir -p test/de-novo/stacks_M{1..9}

然后先 测试 第一个样本

# 项目根目录
M=1
popmap=info/popmap_sample.tsv
reads_dir=01-clean-data
out_dir=test/de-novo/stacks_M${M}
log_file=$out_dir/denovo_map.oe
threads=8
denovo_map.pl -T ${threads} --samples ${reads_dir} -O ${popmap} -o ${out_dir}  -M $M -n $M -m 3 -b 1 -S &> ${log_file} &

代码运行需要一段比较长的时间，这个时候可以学习一下参数： -T 表示线程数， --samples表示样本数据所在文件夹，-O提供需要分析的样本名， -o是输出文件夹，之后就是-M, -n, -m这三个需要调整的参数， -b表示批处理的标识符， -S关闭SQL数据库输出。同时还有遗传图谱和群体分析相关参数，-p表示为亲本，-r表示为后代，-s表明群体各个样本。

为了确保下一步能顺利进行，还需要对oe结尾的日志文件的信息进行检查,确保没有出错

grep -iE "(err|e:|warn|w:|fail|abort)" test/de-novo/stacks_M1/denovo_map.oe

以及以log结尾的日志中每个样本的平均覆盖度，低于10x的覆盖度无法保证snp的信息的准确性

之后对每个参数得到的原始数据，要用populations过滤出80%以上都有的snp位点，即r80位点

# 项目根目录
for M in `seq 1 9`
do
popmap=info/popmap_sample.tsv
stacks_dir=test/de-novo/stacks_M${M}
out_dir=$stacks_dir/populations_r80
mkdir -p ${out_dir}
log_file=$out_dir/populations.oe
populations -P $stacks_dir -O $out_dir -r 0.80 &> $log_file &
done

确定参数

经过漫长的等待后，所有参数的结果都已经保存到特定文件下，最后就需要从之确定合适的参数，有两个指标：

• 多态性位点总数和r80位点数
• 短读堆叠区的snp平均数

尽管这些信息都已经保存在了相应的文本test/de-novo/stacks_M[1-9]/populations_r80/batch_1.populations.log中，但是通过文字信息无法直观的了解总体情况，因此更好的方法是用R处理输出绘图结果。

第一步：提取每个参数输出文件中的log文件中SNPs-per-locus distribution（每个位点座位SNP分布图）信息.新建一个shell脚本，命名为，log_extractor.sh, 添加如下内容

#!/bin/bash
# Extract the SNPs-per-locus distributions (they are reported in the log of populations).
# ----------
echo "Tallying the numbers..."
full_table=n_snps_per_locus.tsv
header='#par_set\tM\tn\tm\tn_snps\tn_loci'
for M in 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ;do
    n=$M
    m=3
    # Extract the numbers for this parameter combination.
    log_file=test/de-novo/stacks_M${M}/populations_r80/batch_1.populations.log
    sed -n '/^#n_snps\tn_loci/,/^[^0-9]/ p' $log_file | grep -E '^[0-9]' > $log_file.snps_per_loc
    # Cat the content of this file, prefixing each line with information on this
    # parameter combination.
    line_prefix="M$M-n$n-m$m\t$M\t$n\t$m\t"
    cat $log_file.snps_per_loc | sed -r "s/^/$line_prefix/"
done | sed "1i $header" > $full_table

运行后得到n_snps_per_locus.tsv用于后续作图。会用到两个R脚本plot_n_loci.R和plot_n_snps_per_locus.R，代码见最后，结果图如下

v

从上图可以发现M=4以后，折线就趋于稳定，并且每个座位上的SNP分布趋于稳定，因此选择M=4作为全样本数据集的运行参数。

全数据集 de novo 分析

和之前基于参考基因组分析的代码类型，只不过将序列比对这一块换成了ustacks。尽管前面用来确定参数的脚本denovo_map.pl也能用来批量处理，但它不适合用于大群体分析。ustacks得到的结果仅能选择40～200个 覆盖度高 且 遗传多样性上有代表性的样本。 使用所有样本会带来计算上的压力，低频的等位基因位点也并非研究重点，并且会提高假阳性。综上，选择覆盖度比较高的40个样本就行了。

第三步：过滤并导出数据

这一步的过滤在stacks1.47是分为两个部分。第一部分是对于从头分析和基于参考基因组都使用rxstacks过滤掉低质量变异，然后重新用cstacks和sstacks处理。第二部分是使用population从群体角度进行过滤。 在stacks2.0时代，rxstacks功能不见了(我推测是作者认为作用不大)，既然他们都不要了，那我也就只用population过滤和导出数据了。

这一步主要淘汰那些生物学上不太合理，统计学上不显著的位点，一共有四个主要参数负责控制，前两个是生物学控制,根据研究主题而定

• (-r):该位点在单个群体的所有个体中的最低比例
• (-p): 该位点至少需要在几个群体中存在
• (--min_maf): 过滤过低频率位点，推荐5～10%
• (--max_obs_het): 过滤过高杂合率位点, 推荐60～70%

# 项目根目录
min_samples=0.80
min_maf=0.05
max_obs_het=0.70
populations -P 03-stacks-analysis/ref-based/ -r $min_samples --min_maf $min_maf \
--max_obs_het $max_obs_het --genepop &> populations.oe
# --genepop表示输出格式，可以选择--vcf等

最后会在03-stacks-analysis/ref-based/生成至少如下几个文件：

• batch_1.sumstats.tsv： 核酸水平上的描述性统计值，如观测值和期望的杂合度 π, and FIS
• batch_1.sumstats_summary.tsv: 每个群体的均值
• batch_1.hapstats.tsv：单倍型水平的统计值，如基因多样性和单倍型多样性
• batch_1.haplotypes.tsv： 单倍型
• batch_1.genepop：指定的输出格式
• batch_1.populations.log：输出日志

至此，上游分析结束，后续就是下游分析。后续更新计划：

• stacks总体流程鸟瞰
• Stacks核心参数深入了解
• RAD-seq和GBS技术比较
• 不同简化基因组protocol的比较
• 学习TASSEL-GBS数据分析流程
• 下游分析探索：这个得慢慢来

代码

SAMPLES,       = glob_wildcards("01-clean-data/{sample}.fq.gz")
INDEX_DICT     = {value: key for key, value in dict(enumerate(SAMPLES, start=1)).items()}
FQ_FILES       = expand("01-clean-data/{sample}.fq.gz", sample=SAMPLES)
# de novo
MISMATCH       = 4 # mismatch number of ustacks
DE_NOVO_LOCI   = expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)
DE_NOVO_CATA   = "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.snps.tsv.gz"
DE_NOVO_MATS   = expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.matches.tsv.gz", sample=SAMPLES)
# ref-based
INDEX          = "reference/index/bwa/gac"
BAM_FILES      = expand("02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam", sample=SAMPLES)
REF_BASED_LOCI = expand("03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)
REF_BASED_CATA = "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.snps.tsv.gz"
REF_BASED_MATS = expand("03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.matches.tsv.gz", sample=SAMPLES)


rule all:
    input: rules.de_novo.input, rules.ref_based.input

rule de_novo:
    input: DE_NOVO_LOCI, DE_NOVO_CATA,DE_NOVO_MATS

rule ref_based:
    input: REF_BASED_LOCI, REF_BASED_CATA, REF_BASED_MATS

# de novo data analysis
## The unique stacks program will take as input a set of short-read sequences
## and align them into exactly-matching stacks (or putative alleles).
rule ustacks:
    input: "01-clean-data/{sample}.fq.gz"
    threads: 8
    params:
        mismatch = MISMATCH,
        outdir   = "03-stacks-analysis/de-novo",
        index    =  lambda wildcards: INDEX_DICT.get(wildcards.sample)
    output:
         "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz",
         "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.tags.tsv.gz",
         "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.models.tsv.gz",
         "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.alleles.tsv.gz",
    log: "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.ustacks.oe"
    shell:"""
    mkdir -p {params.outdir}
    ustacks -p {threads} -M {params.mismatch} -m 3 \
    -f {input} -i {params.index} -o {params.outdir} &> {log}
    """

## choose sample for catalog building
rule choose_representative_samples:
    input: expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.ustacks.oe", sample=SAMPLES)
    output:
        "03-stacks-analysis/de-novo/per_sample_mean_coverage.tsv",
        "info/popmap.catalog.tsv"
    shell:"""
    for sample in {input};do
    name=${{sample##*/}}
    name=${{name%%.*}}
    sed -n "/Mean/p" ${{sample}} |\
    sed "s/.*Mean: \(.*\); Std.*/\\1/g" |\
    paste - - - |\
    sed "s/.*/${{name}}\\t&"
    done | sort -k2,2nr > {output[0]}
    head -n 50 {output[0]} | tail -n 40 | cut -f 1 | sed 's/\([0-9a-zA-Z]*\)_.*/&\t\1/' > {output[1]}
    """

rule de_novo_cstacks:
    input:
        "info/popmap.catalog.tsv",
        expand("03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)
    params:
        stacks_path = "03-stacks-analysis/de-novo/",
        mismatch    = MISMATCH
    threads: 10
    log:"03-stacks-analysis/de-novo/de_novo_cstacks.oe"
    output:
        "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.alleles.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.snps.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1.catalog.tags.tsv.gz"
    shell:"""
        cstacks -p {threads}  -P {params.stacks_path} -M {input[0]} \
        -n {params.mismatch} &> {log}
    """

rule de_novo_sstacks:
    input:
        "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.snps.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.tags.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.models.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.alleles.tsv.gz"
    params:
        catalog = "03-stacks-analysis/de-novo/batch_1",
        sample  = lambda wildcards: "03-stacks-analysis/de-novo/" + wildcards.sample
    output:
        "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.matches.tsv.gz"
    log: "03-stacks-analysis/de-novo/{sample}.sstacks.oe"
    shell:"""
    sstacks  -c {params.catalog} -s {params.sample} -o 03-stacks-analysis/de-novo &> {log}
    """

# reference-based data analysis
## read alignment with bwa-mem
rule bwa_mem:
    input: "01-clean-data/{sample}.fq.gz"
    params:
        index    = INDEX,
        mismatch = "3",
        gap      = "5,5"
    threads: 8
    output: "02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam"
    shell:"""
    mkdir -p 02-read-alignment
    bwa mem -t {threads} -M -B {params.mismatch} -O {params.gap} {params.index} {input} \
        | samtools view -b > {output}
    """

## find variant loci
rule pstacks:
    input: "02-read-alignment/ref-based/{sample}.bam"
    params:
        outdir = "03-stacks-analysis/ref-based/",
        index  =  lambda wildcards: INDEX_DICT.get(wildcards.sample)
    threads: 8
    output:
         "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz",
         "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.tags.tsv.gz",
         "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.models.tsv.gz",
         "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.alleles.tsv.gz"
    log: "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.pstacks.oe"
    shell:"""
    mkdir -p 03-stacks-analysis/ref-based
    pstacks -p {threads} -t bam -f {input} -i {params.index} -o {params.outdir} &> {log}
    """

## A catalog can be built from any set of samples processed by the ustacks or pstacks programs
rule ref_based_cstacks:
    input: "info/popmap.tsv",expand("03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz", sample=SAMPLES)
    threads: 10
    output:
        "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.alleles.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.snps.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1.catalog.tags.tsv.gz"
    shell:
        "cstacks -p {threads} --aligned -P 03-stacks-analysis/ref-based/ -M {input[0]}"

## Sets of stacks, i.e. putative loci, constructed by the ustacks or pstacks programs
## can be searched against a catalog produced by cstacks.
rule ref_based_sstacks:
    input:
        "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.snps.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.tags.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.models.tsv.gz",
        "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.alleles.tsv.gz"
    params:
        catalog = "03-stacks-analysis/ref-based/batch_1",
        sample  = lambda wildcards: "03-stacks-analysis/ref-based/" + wildcards.sample
    output:
        "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.matches.tsv.gz"
    log: "03-stacks-analysis/ref-based/{sample}.sstacks.oe"
    shell:"""
    sstacks --aligned -c {params.catalog} -s {params.sample} -o 03-stacks-analysis/ref-based &> {log}
    """

将以上代码保存为Snakefile，没有集群服务器，就直接用snakemake运行吧。因为我能在集群服务器上提交任务，所以用如下代码

snakemake --cluster "qsub -V -cwd" -j 20 --local-cores 10 &

plot_n_snps_per_locus.R的代码

#!/usr/bin/env Rscript

snps_per_loc = read.delim('./n_snps_per_locus.tsv')
# Keep only M==n, m==3
snps_per_loc = subset(snps_per_loc, M==n & m==3)
# Rename column 1
colnames(snps_per_loc)[1] = 'par_set'

# Create a new data frame to contain the number of loci and polymorphic loci
d = snps_per_loc[,c('par_set', 'M', 'n', 'm')]
d = d[!duplicated(d),]

# Compute these numbers for each parameter set, using the par_set column as an ID
rownames(d) = d$par_set
for(p in rownames(d)) {
    s = subset(snps_per_loc, par_set == p)
    d[p,'n_loci'] = sum(s$n_loci)
    s2 = subset(s, n_snps > 0)
    d[p,'n_loci_poly'] = sum(s2$n_loci)
}

# Make sure the table is ordered
d = d[order(d$M),]

pdf('./n_loci_Mn.pdf')

# Number of loci
# ==========

plot(NULL,
    xlim=range(d$M),
    ylim=range(c(0, d$n_loci)),
    xlab='M==n',
    ylab='Number of loci',
    main='Number of 80%-samples loci as M=n increases',
    xaxt='n',
    las=2
    )
abline(h=0:20*5000, lty='dotted', col='grey50')
axis(1, at=c(1,3,5,7,9))
legend('bottomright', c('All loci', 'Polymorphic loci'), lty=c('solid', 'dashed'))

lines(d$M, d$n_loci)
points(d$M, d$n_loci, cex=0.5)

lines(d$M, d$n_loci_poly, lty='dashed')
points(d$M, d$n_loci_poly, cex=0.5)

# Number of new loci at each step (slope of the previous)
# ==========

# Record the number of new loci at each parameter step
d$new_loci =  d$n_loci - c(NA, d$n_loci)[1:nrow(d)]
d$new_loci_poly = d$n_loci_poly - c(NA, d$n_loci_poly)[1:nrow(d)]

# Record the step size
d$step_size = d$M - c(NA, d$M)[1:(nrow(d))]

plot(NULL,
    xlim=range(d$M),
    ylim=range(c(0, d$new_loci, d$new_loci_poly), na.rm=T),
    xlab='M==n',
    ylab='Number of new loci / step_size (slope)',
    main='Number of new 80%-samples loci as M=n increases'
    )
abline(h=0, lty='dotted', col='grey50')
legend('topright', c('All loci', 'Polymorphic loci'), lty=c('solid', 'dashed'))

lines(d$M, d$new_loci / d$step_size)
points(d$M, d$new_loci / d$step_size, cex=0.5)

lines(d$M, d$new_loci_poly / d$step_size, lty='dashed')
points(d$M, d$new_loci_poly / d$step_size, cex=0.5)

null=dev.off()

plot_n_loci.R的代码

#!/usr/bin/env Rscript

d = read.delim('./n_snps_per_locus.tsv')
# Keep only M==n, m==3.
d = subset(d, M==n & m==3)
# Make sure the table is ordered by number of snps.
d = d[order(d$n_snps),]

Mn_values = sort(unique(d$M))

# Write the counts in a matrix.
m = matrix(NA, nrow=length(Mn_values), ncol=max(d$n_snps)+1)
for(i in 1:nrow(d)) {
    m[d$M[i],d$n_snps[i]+1] = d$n_loci[i] # [n_snps+1] as column 1 is for loci with 0 SNPs
}

# Truncate the distributions.
max_n_snps = 10
m[,max_n_snps+2] = rowSums(m[,(max_n_snps+2):ncol(m)], na.rm=T)
m = m[,1:(max_n_snps+2)]
m = m / rowSums(m, na.rm=T)

# Draw the barplot.
pdf('n_snps_per_locus.pdf')

clr = rev(heat.colors(length(Mn_values)))

barplot(m,
    beside=T, col=clr, las=1,
    names.arg=c(0:max_n_snps, paste('>', max_n_snps, sep='')),
    xlab='Number of SNPs',
    ylab='Percentage of loci',
    main='Distributions of the number of SNPs per locus\nfor a range of M==n values'
    )
legend('topright', legend=c('M==n', Mn_values), fill=c(NA, clr))

null=dev.off()