随着高通量测序技术的飞速发展和多组学分析的广泛应用，科研人员在探索生物学奥秘时经常遇到一个令人又爱又恼的问题：如何从浩如烟海的数据中挖掘出潜在的疾病关联靶点？又如何构建一个全面而有效的诊断或预后模型？只有通过优雅的数据挖掘、精致的结果展示、深入的讨论分析，并且辅以充分的湿实验验证，我们才能锻造出一篇兼具深度与广度的“干湿结合”佳作。
在这期文章里，纽科生物携手同济大学、上海交通大学和上海第六人民医院的顶尖专家，共同带来一篇全新的研究成果。这篇文章刚于今年二月鲜亮登场，发表在《Clinical and Translational Medicine》（影响因子10.6）杂志上。我们提供了关键的转录组测序与数据分析支持，本次“官方”解读旨在为广大生物学研究者呈现一条清晰的研究路径和分析流程。我们将重点解答研究者们最关注的几个问题：数据从哪里来？如何进行分析？如何选择靶点？怎样建立关联？希望这次深入浅出的分享，能激发您的研究灵感，助您一臂之力。
作为一篇有灵魂的文章，我们也有幸邀请到文章一作，王永杰博士为各位读者分享他的科研心路历程。
文章标题：Identifying squalene epoxidase as a metabolic vulnerability in high-risk osteosarcoma using an artificial intelligence-derived prognostic index
中文标题：利用人工智能得到的预后指数（artificial intelligence-derived prognostic index，AIDP1），发现鲨烯环氧酶（SQLE）在高危骨肉瘤中的代谢脆弱性
研究背景
骨肉瘤（OSA）作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，其五年存活率低，且治疗过程极具挑战性。目前，在临床上缺少有效的患者风险分级模型，这大大限制了针对个体患者的治疗策略的制定。为了改善这一现状，本研究致力于发现新的生物标志物，以便更准确地识别高风险的OSA患者。
研究思路
研究优势
- 干湿结合，生信数据挖掘+湿实验验证，高性价比；
- 方法学的多重筛选，多种传统机器学习算法的叠加，综合分析，结果可靠；
- Bulk-seq + scRNA-seq，粗细粒度分析结合。
Q1：来源解析——如何获取数据？
本篇文章生信部分的数据均来自公共数据库。主要使用到的数据集如下表所示：
表1. AIDP1模型构建和靶基因选择所使用的数据集
Q2：如何最大化分析方法价值，构建模型挖掘数据？
AIDPI模型的开发和验证
“机器学习”、“101种算法组合”听起来似乎既复杂又深奥，但熟悉生信的小伙伴们或多或少都听过和使用过几种机器学习算法，例如随机生存森林（RSF）、LASSO回归和支持向量机（SVM）等，这些算法在关键基因的识别中提供了极大的帮助。
绝大多数文章使用的机器学习算法至多3到5种，或类型单一没有组合，而本研究突破了这一瓶颈，创新性地组合了常用的一系列机器学习算法，包括LASSO、GBM、RSF、plsRcox、StepCox、SuperPC、ridge、Survival-SVM、CoxBoost和Enet。就像我们通常在LASSO回归之前使用Cox分析一样，作者将RSF、LASSO、CoxBoost、StepCox这些具备降维和变量筛选功能的算法作为第一步，与其他算法组合起来，于是产生了101种不同的机器学习算法组合。
在所有组合中，CoxBoost和GBM组合的mean C-index最高，预测性能最好，因此选择CoxBoost + GBM作为AIDPI模型（图1）。
图1. 101种算法组合的C-index（此处仅展示Top15算法组合，完整组合请参见文章原文）
Q3：如何充分利用模型，探究对疾病的影响？
AIDPI和临床特征构建预后模型
单因素Cox回归分析表明（图2A），AIDPI可作为OSA患者的预后生物标志物，并同年龄、MSTS分期、Huvos分级和肿瘤原发部位一起，与患者生存显著相关。此外，基于AIDPI、年龄、MSTS分期和原发肿瘤部位构建的列线图在预测OSA患者的生存概率方面，表现优于其他单独的临床特征，验证了其作为预后预测工具的优越性（图2B）。
图2. 基于AIDPI和其他临床病理特征对OSA患者进行生存预测
高AIDPI患者的失调通路
GSEA显示在高AIDPI组中，MYC靶基因、胆固醇稳态和mTORC1信号通路等基因集富集增强，而与凋亡和特定免疫反应相关的基因集则发生负富集（图3A）。KEGG富集分析揭示了对OSA进展至关重要的通路，如PI3K-Akt信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化等（图3B）。
图3. 高AIDPI组患者的通路分析
Q4：如何利用单细胞数据提升颗粒度，进一步挖掘疾病核心？
单细胞分析确定高AIDPI患者核心治疗靶点
我们已经通过构建模型，获得了AIPDI差异基因和AIPDI模型基因。为了进一步缩小基因的范围，作者随后进行了单细胞分析，从6个OSA活检样本中得到了9种细胞类型：OSA细胞、B细胞、内皮细胞、骨髓细胞、NK细胞、成骨细胞、浆细胞、间质细胞和T细胞。对不同细胞类型进行差异比较，以鉴定每种细胞特异性的高表达基因（图4A）。其中，只有8％的DEGs（高、低AIDPI组差异基因）在OSA细胞中表达（图4B）。将单细胞得到的特异性高表达基因、高、低AIDPI组差异基因和AIDPI模型的12个基因取交集（图4C），最终得到3个核心基因：CORT、MYC和SQLE（图4D）。
图4. OSA单细胞数据集分析
Q5：如何寻找关键靶点，与疾病创造关联？
SQLE过表达与OSA进展密切相关
根据canSAR数据库（https://cansar.ai/），只有MYC和SQLE编码的蛋白具备可药用结构，成为高AIDPI患者的潜在治疗靶点。鉴于众多研究已经表明MYC的表达升高与OSA的不良预后相关，作者选择将重点放在SQLE上，进一步探索其作为治疗靶标的潜力。
与正常相邻组织和可能的祖细胞（成骨细胞OB和间充质干细胞MSC）相比，OSA中SQLE表达明显增加（图5A、B）。此外，Huvos I/II级的OSA样本中SQLE表达升高，在MTX（甲氨蝶呤）耐药的Saos2细胞系中也观察到相同的趋势（图5C）。SQLE基因与MYC基因在基因组上邻近，并且二者的拷贝数和mRNA表达水平都呈现出强相关性，这可能导致OSA中SQLE和MYC mRNA水平的同步升高（图5D-H）。SQLE因其位于细胞质中的代谢酶特性，相对于位于细胞核内、难以直接靶向的MYC蛋白而言，提供了一个更易于靶向的治疗靶点。
图5. OSA中SQLE的过表达与肿瘤进展有关
Q6：如何进行湿实验验证？
敲除SQLE阻碍了OSA的进展
为了深入研究SQLE对OSA进展的影响，作者在高内源性SQLE蛋白表达的MNNG和U2OS细胞系中进行了SQLE基因的敲除（图6A），随即发现细胞的恶性表型受到了抑制，包括增殖、集落形成、迁移和侵袭（图6B-E）。此外，在不存在和存在药物治疗的情况下，SQLE沉默都会促进细胞凋亡（图6F、G），并增强肿瘤细胞对 MAP方案（甲氨蝶呤MTX、顺铂DDP和阿霉素ADM）的药物敏感性（图6H）。
图6. SQLE沉默在体内外均可阻碍OSA的进展
在体内外实验中确认SQLE敲除能有效抑制OSA进展之后，作者进一步探讨了SQLE在分子层面对OSA的作用机制。对敲除SQLE的细胞系进行RNA测序后发现，SQLE沉默导致胆固醇稳态基因组发生显著下调（图7A、B），同时导致PI3K-Akt信号通路的显著富集（图7C）和PI3K-Akt-mTOR通路的显著下调（图7D）。此外，SQLE mRNA水平与三种PI3K/mTOR通路拮抗剂的AAC 值显示出强相关性（图7E），表明SQLE mRNA水平可能与此通路的激活有关。后续利用Rescue实验和蛋白印迹实验证明SQLE沉默降低了细胞内胆固醇水平，导致FAK/PI3K/Akt/mTOR信号通路失活，最终抑制OSA进展（图7F-H）。
图7. SQLE沉默可通过降低胆固醇和抑制FAK/PI3K/Akt/mTOR通路来阻止OSA的进展
Q7：如何升华文章，将研究成果应用在疾病治疗中？
SQLE抑制剂阻止了OSA的进展并增强化疗效果
鉴于SQLE能够阻碍OSA的进展，作者考虑到SQLE抑制剂可能具有治疗效果。因此，作者采用了哺乳动物SQLE抑制剂FR194738进行实验，结果表明FR194738能显著抑制OSA细胞的增殖和集落形成，并有效降低细胞内胆固醇水平（图8A-H）。此外，FR194738与常用化疗药物特别是DDP联合使用时，抗肿瘤效果增强（图8I）。这些结果表明FR194738通过靶向SQLE不仅单独有效，而且能增强传统化疗药物的疗效，提供了一种可能的新策略来提高OSA患者的治疗反应。这为未来临床试验和治疗方案的设计提供了重要依据。
图8. SQLE抑制剂FR194738可抑制OSA进展并增进化疗疗效
亮点结论
- 通过机器学习构建了新的OSA预后标志物AIDPI，用于区分胆固醇代谢失调的高风险OSA患者。
- 抑制SQLE能够阻碍OSA的进展，其机制是通过减少胆固醇的生成和抑制FAK/PI3K/Akt/mTOR信号通路。
- 在体内实验中，SQLE抑制剂能够抑制OSA的进展，并增强化疗的效果。
本篇文章思路明确，行文结构清晰。由此推而广之，当将此思路应用于类似问题时，我们需要考虑以下几个方面以优化研究方法（Call Back）：
1) 适用范围：该研究方法主要适用于肿瘤分析。针对非肿瘤疾病，由于缺乏生存状态和生存时间的信息，应用思路时需适当调整替换分析方法。
2) 数据获取：如何有效地获取所需数据，如何整合和利用多个数据集；
3) 分析方法的运用：考虑多种数据分析方法，最大化机器学习在特征选择中的潜力，获得可靠的分析结果；
4) 模型性能与解释力：优秀的模型不仅表现出卓越的预测性能，还能帮助发现并且解释不同表型（计算角度）之间的生物学差异；
5) 综合分析的深度与广度：结合粗、细粒度（Bulk Seq + Single cell Seq），多维度（snATAC + scRNA）分析，深入挖掘分子层面的差异；
6) 结果展示：清晰展示研究成果，特别是将新发现的靶点基因与疾病联系在一起。
7) 实验辅助：湿实验结果验证，增强研究说服力；药物敏感性实验，升华文章价值。
作者写在最后：
非常感谢纽科生物对我的文章做出的解读，并邀请我在这分享一些心得。毕业季的气氛中，我也有诸多感慨和回忆想要分享。
相比上海骨科创新材料领域的其他研究者来说，我的科研成果几乎微不足道。尽管如此，我对自己感到满意，因为我已竭尽全力。每个人的起点不同，可调动的资源也各不相同，短期内的成果自然千差万别。我的满意并非源于文章本身，而是因为我证实了自己的想法是行得通的，我找到了自己的道路。《道德经》中说：“有道无术，术尚可求；有术无道，止于术。”这句古训根据个人经历有着不同的解读。
2017年，我被推免为骨科学术型硕士，但不幸的是，我在临床工作了近2年半，我的实验技能仍停留在本科水平。然而，在不幸中有幸，我有机会在全国最大的骨肿瘤中心之一学习，遇到了许多同龄的骨肉瘤患者。或许是由于我天生的同理心，我渴望找到有效的治疗方法来帮助这些患者，这成了我研究的初衷。因此，我果断将研究方向从骨质疏松转向骨肉瘤。
作为新手的我，所在的课题组也缺乏研究方向和经验。幸运的是，我的导师具有丰富的临床经验，他设计了一套利用临床、影像等指标预测骨肉瘤耐药性的方法，这启发我将这些指标扩展到两万多个个mRNA的表达量，开展数据驱动的研究。这就是我当时找到的“道”。有了这一明确的研究方向，我便开始学习必要的技术。我也曾尝试过建立自己的骨肉瘤多组学数据库，奈何人微言轻，能调动的资源实在有限。我只能转而学习R语言，提升数据挖掘能力，利用公开的数据集开展自己的研究。从2021年开始，我通过生信技能数的在线课程逐步提高自己的生信分析技术，直到2024年2月份才得以发表这一篇文章。尽管有人质疑使用公开数据的价值，也有人认为SQLE在很多肿瘤中都被报道过，缺乏创新性，我却对自己的研究持有不同看法。
我不认同仅追求热门技术的研究方式，也不理解为何“缺乏创新性”的观点会存在。我从未对任何技术抱有过盲目的热情，因为我相信，我们医生的研究应以解决临床问题为核心，将问题拆解成基础科学问题，如果能用最最简单且成熟的技术回答这些问题那就再好不过了。我认为一个研究的创新性在于，我回答了这个问题，且比前人做得更好，这就足够创新。我认为研究中最重要的是逻辑思辨和自我诘问，是条理清晰地讲述自己的故事，这也是研究的乐趣所在。
我相信，每位直接面对患者的医生都有自己的“道”。只要时间足够，他们一定能学会足够的“术”来解决这些问题。如果临床工作太忙，找到一个可靠的团队合作也是一个有效的解决方案。
