Sanger测序

Sanger法测序又称一代测序，在1977年由Frederick Sanger和他的同事首次开发后，它成为了之后40多年里使用最广泛的测序方法。

Sanger

主要发明人Frederick Sanger (1918.8.13 – 2013.11.19)，英国生物化学家，两次获得诺贝尔化学奖，1958年，他因在蛋白质测序领域的贡献而获得该奖，1980年，他与Walter Gilbert因发明了首个DNA测序技术(至今仍在广泛使用)共同分享了他的第二个奖。

冷知识: 测序技术的发展是蛋白质先于RNA，再先于DNA，而Sanger的研究也是顺着这条线，遗憾的是强如Sanger这样的大神在RNA测序的研究上败给了竞争对手，文章被抢发，导致自1958年获得诺奖后陷入了一段低潮，直到1977年才在DNA测序领域取得重大突破，重拾诺奖，上演王者归来。

Sanger测序法在成为最终版本双脱氧核苷酸法之前经历了一系列进化过程，DNA测序最开始的方法也是效仿蛋白质测序的方法，使用酶将核酸切割为大小不同的片段，然后分离片段中的核苷酸。随着合成生物学的发展，核酸引物（primer）的出现，Sanger测序法的前身加减测序法出现了。如图所示，首先利用测序引物结合模板，然后用四种脱氧核苷酸复制模板，其中一种脱氧核苷酸带标记的，理想情况下，这种合成应该是不同步的，并且尽可能随机，这样可以形成最大数量的不同长度的寡核苷酸，以此来作为测序复合体。对于“减法”，就是加入三种脱氧核苷酸和DNA聚合酶，如果是dATP缺失的，就会在为A的前一位停止反应；对于“加法”，就是加入单个脱氧核苷酸和DNA外切酶，如果加入dATP，DNA外切酶会在A这一位停止切割。综合这两种方法，可以得到一个较为准备的结果。

“加减法”原理图

“加减法”胶图

但是“加减法”也有其受限条件，最大的限制就是测序复合物的形成，在实际测序中发现，并不是总会得到所有情况的标记复合物，的标记还是会有一定的偏好性，导致一些复合物的缺失。

1977年，Sanger在PNAS上发表了其诺奖级别的文章，双脱氧核苷酸测序法。

经典的链终止方法需要单链 DNA 模板、DNA 引物、DNA 聚合酶、正常的脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP) 和修饰的二脱氧核苷酸三磷酸 (ddNTP)，ddNTP用来终止 DNA 链的延伸。（如图所示）。DNA 样品分为四个独立的测序反应，包含所有四种标准脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP）和 DNA 聚合酶。每个反应只添加四种双脱氧核苷酸（ddATP、ddGTP、ddCTP 或 ddTTP）中的一种，而其他添加的核苷酸是普通核苷酸。脱氧核苷酸浓度应比相应的双脱氧核苷酸（例如 0.5mM dTTP：0.005mM ddTTP）高约 100 倍，以允许产生足够的片段。延伸结果热变性后进行PAGE凝胶电泳，如图所示，通道中的暗带表示二脱氧核苷酸(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)掺入后链终止的DNA片段。然后，从下到上，利用4个链之间不同条带的相对位置来读取DNA序列。

双脱氧核苷酸测序法原理图

双脱氧核苷酸测序法胶图

自从Sanger利用双脱氧核苷酸进行DNA测序的核心思路提出后，在此基础上DNA测序蓬勃发展。1986年开发了带荧光标记的ddNTP，并进行了商业化，后来整合了微流控和自动化设备后，Sanger测序仪逐步完善为现在的样子。

自动化仪器

饶毅老师称孟德尔为孤独的天才，那么Sanger就是内卷的天才。其独特的实验设计展现了超高的逻辑能力和智商，再看其成果产出也可谓分秒必争，Sanger解析了第一个简单生物噬菌体ΦX174的基因组并发表在Nature，轰轰烈烈的基因组测序浪潮由此开始。1992年，威康基金会和医学研究委员会成立了桑格中心(现在的桑格研究所)，成为目前世界最领先的基因组研究机构之一。桑格于2013年11月19日在剑桥的阿登布鲁克医院(Addenbrooke’s Hospital)睡梦中去世。正如他自己在讣告中所指出的那样，他曾把自己描述为“只是一个在实验室里混日子的家伙”，“在学术上并不出色”。

桑格研究所

也许天才真的对文章没有兴趣，天才努力奋斗，只是想给文章一个安稳的家而已。

参考文献

Sanger sequencing - Wikipedia

Frederick Sanger - Wikipedia

The path to sequencing nucleic acids (whatisbiotechnology.org)

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (December 1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12): 5463–5467.

Sanger, F. & Coulson, A. R. (1975) J. Mol. Blol. 94, 441-448.

Sanger, F., Air, G. M., Barrell, B. G., Brown, N. L., Coulson, A.R., Fiddes, J. C., Hutchison, C. A., Slocombe, P. M. & Smith, M.(1977) Nature 265,687-695.

Smith LM, Sanders JZ, Kaiser RJ, Hughes P, Dodd C, Connell CR, et al. (1986). "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis". Nature. 321 (6071): 674–679.