基于成像的空间转录组：质量控制（1）

引言

本系列讲解 空间转录组学 (Spatial Transcriptomics) 相关基础知识与数据分析教程，持续更新，欢迎关注，转发，文末有交流群！

简介

本章演示的分析用到两份数据：一份是 10x Genomics 的 313-plex Xenium 平台生成的人乳腺癌活检切片数据；另一份是 Bruker 的 1k-plex CosMx 平台生成的小鼠脑切片数据。

接下来，我们会在 Xenium（简称 xen）和 CosMx（简称 cos）两份数据之间来回切换，既用 scuttle 展示 scRNA-seq 通用的质控方法，也用 SpaceTrooper 展示成像类空间转录组特有的质控技巧。最后，把质控合格的 Xenium 数据存盘，供后续继续分析。

依赖

library(arrow)
library(dplyr)
library(tidyr)
library(scater)
library(ggplot2)
library(ggspavis)
library(patchwork)
library(OSTA.data)
library(SpaceTrooper)
library(STexampleData)
library(SpatialExperiment)
library(SpatialExperimentIO)

数据导入

SpatialExperimentIO 帮你一键把 CosMx（Bruker）、Xenium（10x Genomics）和 MERSCOPE（Vizgen）这三家厂商的输出文件读成 SingleCellExperiment 或 SpatialExperiment 对象。

我们从 STexampleData 加载 Xenium 数据集

(xen <- Janesick_breastCancer_Xenium_rep1())
# required for visuals
xen$in_tissue <- TRUE 
xen$sample_id <- "Xenium"

为了把 CosMx 数据加载成 SpatialExperiment 对象，我们使用 SpatialExperimentIO 的 readCosmxSXE 函数。为了避免 RNA 靶标计数与阴性探针或系统对照产生的计数混淆，后者默认被移入 altExps。我们还会额外添加 ggspavis（用于可视化）和 SpaceTrooper（用于分析）所需的 colData 和 metadata 槽。SpaceTrooper 的 updateCosmxSPE 函数会负责将对象的 colData 标准化，以便与 SpaceTrooper 的函数配套使用。

# retrieve CosMx dataset from OSF repo
id <- "CosMx1k_MouseBrain2"
pa <- OSTA.data_load(id, mol=FALSE)
dir.create(td <- tempfile())
unzip(pa, exdir=td)
cos <- readCosmxSXE(td, addTx=FALSE)
# prepare data for 'SpaceTrooper' 
cos <- updateCosmxSPE(cos, td, sampleName="CosMx")
cos <- readAndAddPolygonsToSPE(cos)
cos$in_tissue <- TRUE
cos

可视化

基于成像的空间转录组（Imaging-based ST）数据依赖于对 2D 组织切片的成像。因此，与 scRNA-seq 相比，一个优势在于我们可以轻松地将细胞的 2D 图谱可视化，并直接把细胞特征绘制在该图上。最简单的可视化方式是把细胞表示为质心（centroids），这有助于获得组织的全局鸟瞰图。

# spatial plots for datasets acquired through
# Xenium & CosMx (points = cell centroids)
plotCoords(xen, point_size=0, y_reverse = FALSE) + ggtitle(xen$sample_id) +
plotCoords(cos, point_size=0, y_reverse = FALSE) + ggtitle(cos$sample_id)

通用 QC 指标

与 scRNA-seq 类似，质量控制（QC）是剔除低质量细胞、并在样本、视野（FOV）或玻片区域层面揭示特定偏差的关键步骤。然而，与 scRNA-seq 和基于测序的空间转录组不同，大多数成像类 ST 平台并不测量整个转录组，也不测量其“无偏”样本，而是依赖预先设计的基因 panel。

根据平台和应用场景，这些 gene panel 可能是泛组织的，也可能针对特定组织或细胞类型；其规模从几百个基因（如首批 Xenium 的 313 个）到几千个（如 Xenium 5k panel 或 CosMx 的 6k、18k panel）不等。因此，与测序类平台不同，我们可能没有足够的核糖体或线粒体转录本来计算 QC 指标。不过，成像平台提供了一组 negative probes，可用于检测非特异性 RNA 捕获。

最后，成像类平台除转录本数据外，还附带形态学信息（如分割细胞的面积与偏心率）以及抗体染色信息（如靶向细胞核或膜表面的染色）。

scRNA-seq

我们首先用 scuttle 包计算 scRNA-seq 标准 QC 指标。此处设置 use.altexps=TRUE，可在对主对象中 RNA 靶标定量的同时，也对 altExps 里的负探针等附加特征进行定量。

# compute standard scRNA-seq QC metrics for the Xenium dataset (e.g.,
# total counts & unique features, for RNA targets & negative probes)
xen <- addPerCellQCMetrics(xen, use.altexps=TRUE)

IF 染色

CosMx 输出通常包含一组免疫荧光（IF）标记的最小/最大/平均强度，例如用于分割的核和细胞表面标记，以及实验相关的额外标记。在此，我们展示 CosMx 样本中平均 IF 强度的分布。

flu <- grepv("^Mean", names(colData(cos)))
lapply(flu, \(.) {
    cos[[.]] <- asinh(cos[[.]]/10)
    plotCoords(cos, annotate=., point_size=0, y_reverse = FALSE)
}) |>
    wrap_plots(nrow=1) &
    theme(
        legend.position="bottom", 
        legend.key.height=unit(0.4, "lines")) &
    scale_color_gradientn(colors=pals::jet())

形态学

SpaceTrooper 的 spatialPerCellQC 函数可计算一组成像类 ST 数据特有的指标；示例见下文。此外，该函数内部还会调用 scuttle 包的 perCellQCMetrics，对 altExp 中的负探针计算若干标准 scRNA-seq 质控指标。

# compute 'SpaceTrooper' QC metrics
cos <- spatialPerCellQC(cos, use_altexps="NegPrb")
# the following cell metadata are newly available:

具体而言，下列指标已被追加到 colData 中：

• Area_um：细胞面积，单位为微米²
• CountArea：计数密度 = 每微米² 的转录本数量
• log2AspectRatio：细胞长宽比（x 轴 / y 轴）的 log₂ 值
• ctrl_total_ratio：负探针计数占总计数的比例

计数与面积

基于成像的空间转录组数据依赖对二维组织切片的成像。因此，细胞只是三维体系中的一层切片，我们预期细胞的转录本计数与其截面面积存在紧密关联。当我们分别检视总计数与细胞面积这两个单变量分布时，二者均近似呈对数正态分布。

.p <- \(df, xs) {
    fd <- pivot_longer(df, all_of(xs))
    mu <- summarise_at(group_by(fd, name), "value", median)
    ggplot(fd, aes(value)) + facet_grid(~ name) + 
        geom_histogram(bins=50, linewidth=0.1, fill="gray") + 
        geom_vline(data=mu, aes(xintercept=value), col="blue") + 
        geom_text(
            hjust=-0.1, size=3, col="blue", 
            data=mu, aes(value, 0, label=round(value))) + 
        scale_x_continuous(NULL, trans="log10") + ylab("# cells") + 
        theme_minimal() + theme(panel.grid.minor=element_blank())
}
df_cos <- data.frame(colData(cos), spatialCoords(cos))
df_xen <- data.frame(colData(xen), spatialCoords(xen))
p2 <- .p(df_cos, c("Area_um", "total"))
p1 <- .p(df_xen, c("cell_area", "total_counts"))
p1 + ggtitle("CosMx") | p2 + ggtitle("Xenium")

同样，我们可以把这些指标在组织里的分布画出来：用细胞质心做底，分别按总转录本数和细胞面积上色，一目了然。

lapply(c("cell_area", "total_counts"), \(.) {
    # crop very low/high values for clearer visualization
    val <- xen[[.]]
    qs <- quantile(val, c(0.01, 0.99))
    val <- ifelse(val < qs[1], qs[1], ifelse(val > qs[2], qs[2], val))
    xen[[.]] <- val
    plotCoords(xen, annotate=., point_size=0, y_reverse = FALSE) +
        theme(legend.key.width=unit(0.5, "lines")) +
        scale_color_gradientn(colors=unname(pals::jet()), trans="log10")
}) |> wrap_plots(nrow=1)

放到双变量图里，计数和面积果然呈正相关，但关系并不总是线性，有时还会出现双峰。

.p <- \(df, x, y) {
    ggplot(df, aes(.data[[x]], .data[[y]])) + 
        geom_point(shape=16, size=0, alpha=0.1) + 
        geom_smooth(method="lm", col="blue") +
        scale_x_log10() + scale_y_log10() +
        theme_minimal() + theme(
            aspect.ratio=1, 
            panel.grid.minor=element_blank())
}
.p(df_cos, "Area_um", "total") + ggtitle("CosMx") +
.p(df_xen, "cell_area", "total_counts") + ggtitle("Xenium")

某些异常的“计数-面积”分布可能暗示分割出了问题。欠分割（把一群细胞误当成一个巨细胞）时，面积虽大，计数却偏低——比如细胞其实离得老远，却把空白也圈了进来。