今天给大家分享一篇IF=7.9的网络药理学的文章，2023年6月发表在Phytomedicine：Network pharmacology-based study on the mechanism of ShenKang injection in diabetic kidney disease through Keap1/Nrf2/Ho-1 signaling pathway，基于网络药理学研究肾康注射液通过Keap1/Nrf2/Ho-1信号通路治疗糖尿病肾病的机制
摘要
- 目的：通过网络药理学以及体内和体外实验，研究肾康注射液（
SKI）对DKD大鼠肾脏的影响，及其对由Keap1/Nrf2/Ho-1信号通路介导的氧化应激的作用。 - 方法：通过
TCMSP筛选SKI药物靶点，通过GenGards、OMIM、Drugbank、TTD和Disgenet数据库筛选DKD靶点，并对两者交集进行PPI网络分析，通过GO和KEGG进行靶点预测。随机将40只SD大鼠分为对照组10只和模型组30只。模型组喂食高糖高脂饮食8周后，通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg）构建DKD模型。按体重，将模型动物随机分为三组：模型验证组8只，厄贝沙坦（每日25 mg/kg）组8只，SKI组8只（5 ml/kg）。对照组和模型验证组灌胃去离子水。观察大鼠的一般情况，测量其体重，记录24小时的尿量。干预16周后，收集血清检测尿素、Scr、血脂以及氧化应激和脂质过氧化指标；使用透射电子显微镜、HE和Mallory染色观察肾组织的病理形态。免疫组化和RT-PCR用于检测大鼠肾组织中Keap1、Nrf2、Ho-1、Gpx4蛋白和mRNA的表达。体外培养HK-2细胞，并分为：对照组、AGEs（200 μg/ml）组和AGEs + SKI组。细胞培养48小时后，使用CCK-8检测各组细胞活性，并使用荧光探针检测ROS。免疫荧光检测Gpx4的表达，而Western Blot用于检测Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4。 - 结果：网络药理学分析预测，肾康注射液（SKI）可能通过影响与氧化还原相关的信号通路并减轻AGEs诱导的氧化应激，从而延缓DKD肾损伤。在动物实验中，与模型验证组相比，
SKI组大鼠的一般状态得到了改善，24小时尿蛋白水平显著降低，血清中的Scr减少。尿素、TC、TG和LDL的水平明显下降，ROS、LPO和MDA的水平也显著降低。病理染色显示，肾间质纤维化明显改善，电子显微镜显示足突效应得到缓解。免疫组化和RT-PCR显示，SKI组大鼠肾组织中Keap1蛋白和mRNA的表达减少。此外，Nrf2、Ho-1和Gpx4蛋白和mRNA明显上调。在细胞实验中，经AGEs处理48小时后，HK-2细胞中的ROS显著增加，细胞活性显著降低，而AGEs + SKI组的细胞活性显著增加，ROS降低。AGEs + SKI组HK-2细胞中Keap1蛋白的表达减少，而Nrf2、Ho-1和Gpx4蛋白的表达显著增加。 - 结论：SKI可以保护DKD大鼠的肾功能，延缓DKD的进展，抑制
AGEs在HK-2细胞中诱导的氧化应激损伤，SKI改善DKD的机制可能是通过激活Keap1/Nrf2/Ho-1信号转导通路来实现的。
分析流程
结果
图 1. SKI-DKD网络的药理学分析
(A) Venny图。 (B) PPI蛋白质相互作用图。 (C) 药物-组分-疾病-靶标网络。 (D) GO富集分析。 (E) KEGG富集分析。
图 2. SKI对DKD大鼠体重、24小时尿蛋白、肾功能和血脂的影响
- (A) 从8周到24周大鼠的体重变化。
- (B) 从8周到24周大鼠的24小时尿蛋白变化。
- (C, D) 各组大鼠的血清SCR和尿素水平。
- (E - G) 不同组的TC、TG和LDL水平。
注：Irb: 伊贝沙坦; SKI: 肾康注射液。数据通过单向ANOVA进行分析 (均值 ± 标准误差)。N = 6。*p < 0.05, **p < 0.01 与对照组相比；#p < 0.05, ##p < 0.01，与模型验证组相比。
图 3. SKI对DKD大鼠血清氧化应激及肾组织脂质过氧化的影响
- (A) - (C) 不同组之间的ROS、SOD和NO水平。
- (D) - (E) 每组肾组织的LPO和MDA水平。
- (F) 每组肾脏中的铁离子。
图 4. SKI缓解DKD大鼠的肾脏组织病理损伤
- 注：Irb: 伊贝沙坦; SKI: 肾康注射液。在HE染色中，箭头显示大鼠肾组织的病理变化（刻度尺 = 50 μm）。在Mallory染色中，箭头显示肾小球硬化和肾间质纤维化（刻度尺 = 50 μm）。TEM中的箭头显示肾小球基底膜增厚和足突消失（刻度尺 = 2 μm）。
图 5. SKI对DKD大鼠肾组织中Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4 mRNA表达水平的影响
- (A) Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。
- (B) 每组中Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4 mRNA的水平。
图 6. SKI对DKD大鼠肾组织中Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4蛋白表达水平的影响
- (A) Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4免疫组化实验的代表性图像（刻度尺：50μm）。
- (B) DKD大鼠中Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4蛋白表达的阳性表达区域的统计结果。
图 7. SKI对被AGEs损伤的HK-2细胞活性和ROS的影响
- (A) CCK-8实验检测了SKI的最佳浓度。
- (B) SKI在AGEs损伤的HK-2细胞作用24小时和48小时后对细胞活性的影响。
- (C) SKI对AGEs损伤的HK-2细胞形态的影响（刻度尺：50μm）。
- (D) SKI对AGEs损伤的HK-2细胞中ROS的影响（刻度尺：50μm）。
图 8. SKI对被AGEs损伤的HK-2细胞中keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4蛋白的影响
- (A) 免疫荧光法检测SKI对Gpx4蛋白表达的影响（刻度尺：50μm）。
- (B) 通过Western Blot研究SKI对Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4表达的影响。
- (C) Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4蛋白带的统计分析。
- 注：数据表示为平均值（SEM）。N = 3。*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比；#p < 0.05，##p < 0.01与AGEs组相比。
图 9. SKI对Keap1/Nrf2/Ho-1信号通路影响的示意模型
小总结
- 本篇十分适合有充足
动物模型+细胞实验条件的课题组借鉴学习，研究思路也是很清晰的：网药四部曲（药物-疾病靶点交集、PPI网络、GOKEGG通路分析），比较肾功能标志物、血脂水平、血清氧化应激水平、肾组织中脂质过氧化水平和铁离子，组织病理，电泳mRNA表达，免疫组化，免疫荧光 - 这篇研究充分的展现了生物信息学作为工具所发挥的作用，老板曾说过
生信的初衷是解决一个科学问题，这篇网药就真的是在遍地发文的环境下有着一点清新脱俗之意
