Tutorial地址：https://sourceforge.net/p/mageck/wiki/
Paper：Li, et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology 15:554 (2014)
安装
Conda安装(推荐)
conda create -c bioconda -n mageckenv mageck # 环境中python版本要大于3 source activate mageckenv conda update mageck source deactivate
Docker安装
可以follow这个流程https://sourceforge.net/p/mageck/wiki/demo/#tutorial-3-run-mageck-on-docker-image
源码安装
最新版的MAGeCK(0.5.9)下载地址为：https://sourceforge.net/projects/mageck/files/latest/download
tar xvzf mageck-0.5.4.tar.gz cd mageck-0.5.4 python setup.py install ## 如果你想要安装MAGeCK安装到你自己的目录下 python setup.py install --user ## $HOME是你的root目录 python setup.py install --prefix=$HOME ## 设置环境变量 export PATH=$PATH:$HOME/bin
MAGECK RRA算法
下载测试数据
我们直接使用 Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library这篇文章中的数据集中的两个样本为示例，在本文中，作者对小鼠ESC细胞进行了CRISPR / CAS9筛选，并鉴定了小鼠ESC细胞中必需的基因。
准备文件：
- 测序数据 ：对照组 ERR376998 (one replicate of plasmid)、处理组 ERR376999 (one replicate of ESC)
- sgRNA库文件：yusa_library.csv 包含测序sgRNAid、序列、靶向基因
sgRNA文库
数据下载地址：http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP003292
sgRNA库文件：https://sourceforge.net/projects/mageck/files/libraries/
数据的下载方式可以参考 一文。
数据下载后进行解压
gunzip ERR376998.fastq.gz gunzip ERR376999.fastq.gz
count获取样本比对数据
mageck count -l yusa_library.csv -n escneg --sample-label "plasmid,ESC1" --fastq ERR376998.fastq ERR376999.fastq
| 参数 | 解释 |
| -l yusa_library.csv | 提供的sgRNA信息包含sgRNA id,序列和靶向的基因(支持csv与tab分割) |
| -n demo | 输出文件的前缀 |
| --sample-label L1,CTRL | L1 (test1.fastq) and CTRL (test2.fastq)两个样本的标签 |
| --fastq test1.fastq test2.fastq | 测序的fastq序列 |
| --pdf-report | 对测序数据的统计信息提供pdf报告文档 |
| --trim-5 （可选） | 切除5段接头序列 |
我们打开ERR376998文件可以看到各序列的前23个碱基是一致的，我们可以设置--trim-5参数手动切除这些序列，但是从version 0.5.6版本后, MAGeCK现在可以自动识别fastq文件中一致序列进行切除，因此这个参数是可选的。
test比较样本差异
当我们得到count矩阵后，就可以用test命令进行组间差异分析
mageck test -k escneg.count.txt -t ESC1 -c plasmid -n esccp
| 参数 | 解释 |
| -k escneg.count.txt | count命令得到的各样本read count矩阵 |
| -t | 指定处理组数据 |
| -c | 指定对照组数据 |
| -n demo | 输出文件的前缀 |
如果成功，可以看到"esccp.gene_summary.txt"文件, 可以看到两个核糖体基因 RPS5和RP19在阴性筛选的前几名
id num neg|score neg|p-value neg|fdr neg|rank neg|goodsgrna pos|score pos|p-value pos|fdr pos|rank pos|goodsgrna GTF2B 5 2.0462e-10 2.5851e-07 0.000707 1 5 1.0 1.0 1.0 19150 0 RPS5 5 5.9353e-10 2.5851e-07 0.000707 2 5 1.0 1.0 1.0 19149 0 RPL19 4 2.695e-09 2.5851e-07 0.000707 3 4 1.0 1.0 1.0 19148 0 KIF18B 5 1.0136e-08 2.5851e-07 0.000707 4 5 1.0 1.0 1.0 19146 0
如果我们想看阳性筛选排序，可以将第11列进行排序，发现 TPR53在前几名
## 排序 sort -k 11,11n esccp.gene_summary.txt | less id num neg|score neg|p-value neg|fdr neg|rank neg|goodsgrna pos|score pos|p-value pos|fdr pos|rank pos|goodsgrna ZFP945 5 1.0 1.0 0.999999 19150 0 9.6166e-07 5.4287e-06 0.05198 1 5 TRP53 5 0.95411 0.95409 0.999999 17901 0 1.0347e-06 5.4287e-06 0.05198 2 4 PDAP1 5 0.85937 0.86223 0.999999 15753 1 7.6412e-06 2.8178e-05 0.174505 3 2
文件信息如下：
| Column | Content |
| id | Gene ID |
| num | The number of targeting sgRNAs for each gene |
| neg|score | The RRA lo value of this gene in negative selection |
| neg|p-value | The raw p-value (using permutation) of this gene in negative selection |
| neg|fdr | The false discovery rate of this gene in negative selection |
| neg|rank | The ranking of this gene in negative selection |
| neg|goodsgrna | The number of "good" sgRNAs, i.e., sgRNAs whose ranking is below the alpha cutoff (determined by the --gene-test-fdr-threshold option), in negative selection. |
| neg|lfc | The log2 fold change of this gene in negative selection. The way to calculate gene lfc is controlled by the --gene-lfc-method option |
| pos|score | The RRA lo value of this gene in positive selection |
| pos|p-value | The raw p-value (using permutation) of this gene in positive selection |
| pos|fdr | The false discovery rate of this gene in positive selection |
| pos|rank | The ranking of this gene in positive selection |
| pos|goodsgrna | The number of "good" sgRNAs, i.e., sgRNAs whose ranking is below the alpha cutoff (determined by the --gene-test-fdr-threshold option), in positive selection. |
| pos|lfc | The log fold change of this gene in positive selection |
同样我们可以添加--pdf-report参数，生成一个统计报告，便于分享展示。
【关于筛选】：这是一项重要步骤，根据研究目的不同，CRISRP共同量测序分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指的是施加一定筛选压力，经过文库扰动后野生型细胞致死，仅有获得抗性的细胞存活，与阳性筛选不同，阳性筛选是通过比较不同筛选时间点的sgRNA丰度差，获得缺失的sgRNA，分析所对应的基因，从而找出可能影响细胞生长的候选基因。
MAGeCK MLE算法
除了传统的RRA算法，从0.5版本以后，MAGeCK提供了一个新的算法MLE，计算一个称为beta score的指标代表基因的重要程度，其实和转录组中差异分析中的log fold change指标类似，相比于RRA算法，这种方法有以下优势：
- 每个基因只会得到一个分数，而不是RRA中的两个分数：一个用于阳性选择，一个用于阴性选择。
- 它允许在多种条件(多组情况)下直接比较。
- 它包含各个sgRNA的干扰效率信息。
构建design matrix文件
这个design matrix文件表明那个样本被哪个条件所影响，通常是一个二进制矩阵，指示哪个样本（第一列指示）受到哪个条件的影响（由第一行表示）。
对于以上的数据 对照组 ERR376998 (one replicate of plasmid)、处理组 ERR376999 (one replicate of ESC)，我们可以构建这样的矩阵designmat.txt
Samples baseline plasmid ESC1 plasmid 1 0 0 ESC1 1 1 0
注意：
- 矩阵必须包含一个表头代表条件标签
- 第一列是样本的标签
- 第二列是必须是一个"baseline"列，所有值必须为1
- 表里的数字必须是0 或 1
- 必须设置一个初始状态的样本（比如day 0或者plasmid）
run the module
mageck mle -k escneg.count.txt -d designmat.txt -n yusa
执行成功后，会生成3列文件：log.file、 gene_summary file (包含 gene beta scores)、 sgrna_summary file (包含sgRNA efficiency probability predictions).,查看gene_summary.file：
文件信息如下：
| Column | Content |
| Gene | Gene ID |
| sgRNA | The number of targeting sgRNAs for each gene |
| plasmid|beta;ESC1|beta | The beta scores of this gene in conditions "plasmid" and "ESC1", respectively. The conditions are specified in the design matrix as an input of the mle subcommand. |
| plasmid|p-value | The raw p-value (using permutation) of this gene |
| plasmid|fdr | The false discovery rate of this gene |
| plasmid|z | The z-score associated with Wald test |
| plasmid|wald-p-value | The p value using Wald test |
| plasmid|wald-fdr | The false discovery rate of the Wald test |
其他参数
plot
我们可以使用plot命令对单独挑选出的基因绘图
usage: mageck plot [-h] -k COUNT_TABLE -g GENE_SUMMARY [--genes GENES] [-s SAMPLES] [-n OUTPUT_PREFIX] [--norm-method {none,median,total}] [--keep-tmp]
| Parameter | Explanation |
| -k COUNT_TABLE, --count-table COUNT_TABLE | Provide a tab-separated count table. |
| -g GENE_SUMMARY, --gene-summary GENE_SUMMARY | The gene summary file generated by the test command. |
| -h, --help | show this help message and exit |
| --genes GENES | A list of genes to be plotted, separated by comma. Default: none. |
| -s SAMPLES, --samples SAMPLES | A list of samples to be plotted, separated by comma. Default: using all samples in the count table. |
| -n OUTPUT_PREFIX, --output-prefix OUTPUT_PREFIX | The prefix of the output file(s). Default sample1. |
| --norm-method {none,median,total} | Method for normalization, default median. |
| --keep-tmp | Keep intermediate files. |
## 举例子 单独绘制 GRHL2 BIK这两个基因 mageck plot -k escneg.count.txt -g esccp.gene_summary.txt --genes GRHL2,BIK
可以看到plot命令将这两个基因每个sgRNA的变化，阳性和阴性筛选中按照P值和RRA score排序的图形绘制了除了，多个基因直接中间以，分割即可。
MAGECKGsea
MAGECKGSEA是使用C ++的基因设定富集分析（GSEA）的快速实现。与官方GSEA软件相比，主要优势是其易于使用和极快的运行速度。
作者这里也提供了gsea示例文件供我们练习：https://bitbucket.org/liulab/mageck/src/master/gsea/，其实只用到两个参数
mageckGSEA -r demo1.txt -g kegg.ribosome.gmt -c 1 -p 10000
| Parameter | Explanation |
| -r rank_file, --rank_file rank_file | (required) Rank file. The first column of the rank file must be the gene name. |
| -g gmt_file, --gmt_file gmt_file | (required) The pathway annotation in GMT format. |
| -p perm_time, --perm_time perm_time | Permutations, default 1000. |
| -c score_column | The column for gene scores. |
生成GSEA结果文件如下：
Pathway Size ES p p_permutation FDR Ranking Hits LFC KEGG_RIBOSOME 88 0.3262 0.00240772 0.0045 0.0045 0 32 0
| Item | Explanation |
| Pathway | The name of the pathway |
| Size | The size of the pathway, i.e., the number of genes |
| ES | Enrichment Score (ES) in GSEA |
| p | The p value of ES |
| p_permutation | The permutation p value of ES (usually more accurate than p |
| FDR | False Discovery Rate of p_permutation |
| Ranking | The ranking of this pathway |
| Hits | The number of genes that are ranked before ES score. See "Leading Edge" analysis of GSEA |
| LFC | Log fold change (not implemented) |
速度确实挺快，感觉可作为官方GSEA软件做基因集富集一种替代方式，只需要自己制作好GMT文件即可，不懂该格式的可以参考GSEA官网介绍：
Advanced tutorial
包含允许read mapping误差、纠正拷贝数变异影响、Docker iamge运行MAGeCK及更复杂设计实验条件下的操作，感兴趣看教程https://sourceforge.net/p/mageck/wiki/advanced_tutorial/
输入/出格式
更详细的参数介绍可直接看源文档
输入：https://sourceforge.net/p/mageck/wiki/input/
输出：https://sourceforge.net/p/mageck/wiki/output/
其它工具
除了MAGeCK, 该团队还开发了其他的软件与算法:
- MAGeCK-VISPR: 制动CRISPR//Cas9筛查的开发的集质控，分析和可视化一体的workflow
- MAGeCKFlute: 一个交互分析的pipelineR包
- scMAGeCK: 一个结合单细胞转录组数据与Crispr筛查数据综合分析的计算模型
- Vispr-online：在线版分析筛选数据集
后续有时间再来慢慢学习吧~~~
