转录组测序类型
1. 根据RNA种类
可以分为mRNA测序，SmallRNA测序，LncRNA测序、CircRNA测序、全转录组测序等
2. 根据物种特点
比如真核生物或者原核生物，是否有参考基因组，测序平台的不同，分为真核有参和无参转录组测序，原核转录组测序，全长转录组测序等
3. 根据相互关系
分为互作转录组，比较转录组等等；
此外，基因组甲基化会影响到基因的转录调控，也属于转录调控测序范畴；还有用于研究转录因子与DNA的交互作用或组蛋白修饰在基因组上的分布的ChIP-Seq，研究RNA与蛋白互作关系的RIP-Seq，以及研究RNA甲基化的MeRIP-Seq等。
应用领域
术语概念
基本的术语介绍：
- 转录本：是由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。
- PE 150/SE 150：PE（Pair end）为双端测序的意思，测序文库中的一条序列从两端开始读取，得到read 1与read 2，即通常所说的R1与R2。SE（Single end）为单端测序的意思，即一条序列从一端读取。这里的150为150bp的意思，即读取150bp长度的测序模式。
- Read：测序得到的每一条序列称为一个 Read。
- Raw Data/ Raw Reads：测序下得到的原始图像数据经过base calling转化而来的机的原始数据。
- Clean Data / Clean Reads：去除接头和低质量 Reads 后的数据，后续分析均基于Clean Data。统计指标为Q20/Q30的值，一般平均质量分数< Q20,
- 接头/ Adapter：接头是测序时在序列两端分别加上的一段人工序列，接头上含有与测序引物互补结合的序列，通过和测序引物结合来对目的片段进行测序。当加上接头后的序列片段比实际测序读长短时， 3’端会测到接头序列，接头序列在分析之前需要去除掉。
- RPKM:Reads Per Kilobase of exon modelper Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)，主要用来对单端测序（single-end RNA-seq）进行定量的方法。
- FPKM:Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)，主要是针对pair-end测序表达量进行计算（公式算法基本与上述RPKM一致，两种都是RNAseq中常见的标准化方法，除此还有其他标准化方法后续会再单独介绍）。
- 模糊碱基/ N：测序中不能确定的碱基，以N表示。一条序列中 N 越多说明该序列质量越低，一般该种序列需要剔除掉。
- Read count：比对到一个基因上的 Reads 数目。
- P value：显著性，统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P < 0.05 为显著， P <0.01 为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05 或0.01。
- 差异倍数(Fold change)：fold change翻译过来就是倍数变化，假设A基因表达值为1，B表达值为3，那么B的表达就是A的3倍。一般我们都用count、TPM或FPKM来衡量基因表达水平，所以基因表达值肯定是非负数，那么fold change的取值就是(0, +∞)。
- log2 Fold Change：同一基因在两个样品中的表达量之商取2的对数，即log2（sampleA/sampleB）。
注意：
为什么我们经常看到差异基因里负数代表下调、正数代表上调？因为我们用了log2 fold change。当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就大于1，log2 fold change就大于0（见下图），B相对A就是上调；当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就小于1，log2 fold change就小于0。通常为了防止取log2时产生NA，我们会给表达值加1（或者一个极小的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1).
为什么不直接用表达之差，差直接有正负啊？假设A表达为1，B表达为8，C表达为64；直接用差B相对A就上调了7，C就相对B上调了56；用log2 fold change，B相对A就上调了3，C相对B也只上调了3. 通过测序观察我们发现，不同基因在细胞里的表达差异非常巨大，所以直接用差显然不合适，用log2 fold change更能表示相对的变化趋势，但是呢虽然大家都在用log2 fold change，但显然也是有缺点，这里给大家推荐个链接看下，作者解释的很详细~
- 另外我们也要具备基本分子生物学常识如转录、翻译的过程(中心法则)，以及何为外显子，内含子，前体RNA，CDS，ORF这些概念，这些课本或网上都有介绍，不再过多赘述。
中心法则
前体RNA
关系：
流程
测序流程
- 样品RNA准备
- 测序文库构建
- DNA成簇(Cluster)扩增
- 高通量测序(Illumina)
- 数据分析
链特异性建库(了解)
目前构建链特异性文库的方法有多种，其中用的最普遍的是dUTP方法，跟普通建库方式相比，链特异性建库会在第二链 cDNA 合成时，用dUTP代替dTTP，加接头后用UDGase处理，降解掉有U的第二条cDNA，这样使得测序后的数据可以确定链的方向性，从而可以判断转录本是来自正义还是反义DNA链。与普通转录组测序相比，它能更准确地统计转录本的数量和确定基因的结构。推荐个帖子感兴趣的可以学习一下该建库方式的原理
下面通过这张建库示意图来看看普通RNA-Seq建库和链特异性建库的差异在什么地方
数据分析流程
数据量大小
转录调控测序所需的数据量随项目类型不同而有所差异，数据量还与基因组大小、复杂度有关目前，为保证数据分析结果的可靠性和准确性，对于Illumina平台、PacBio平台：
真核转录组测序推荐采用6Gb 数据量进行后续分析，如果想检测到更低丰度的转录本，推荐采用8-10Gb数据量；
原核生物转录组，推荐采用4Gb数据量进行后续分析；
关注点
转录组的分析大致有以下几种情况：
- 同一物种在发育过程中的各时间节点的基因表达特点及存在的差异；
- 不同品系之间存在的差异表达基因；
- 不同的外界条件处理，如细菌、真菌、病毒、光照、紫外、干旱、高温、高盐胁迫，对基因表达的影响；
- 同一个体，不同组织之间的基因表达差异。
其他常见问题
生物学重复问题
生物学差异是基因自身表达的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关，如果没有生物学重复，或者生物学重复的数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果。获得的差异表达基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，并不能反映疾病或者某种特定生理状态的群体本质特征，并且有些审稿人会很在意生物学重复这个问题。
- 对于动植物样品，建议5个以上生物学重复，对生物学样品之间做相关性检验，提高实验结果的可信度。
- 对于细胞样品，生物学重复之间的差异性相对较小，建议3个以上生物学重复。
- 对于临床样品，由于供试者的基因型、生活方式、生活环境、年龄、性别可能存在差异，需要更多的生物学重复，一般要求10个生物学重复以上。
对于有无生物学重复后续计算差异基因时候算法也是不同的，目前主流差异分析软件DEseq2，limma，edgeR等基本都是针对有重复的转录组数据。至于没有重复的转录组数据，edgeR包中其实也有一种方法去计算，或者我们可以简单算两组的fold change然后根据阈值去筛选，另外同济大学之前也发布过一款软件GFOLD软件可以针对无重复数据计算(后续再说)。
差异倍数很大但P值>0.05不显著
对于差异倍数较大，但P值也较大，差异不显著的原因，可能有两个：
- 生物学重复不好，即生物学个体之间差异比较大，从统计学角度讲，就是同一个基因在组内的差异较大，误差线比较大，这样往往差异不显著。比如，某个基因在A组的三个生物学重复的表达量分别为100、200、300，在另一组中为110、150、30，虽然平均值差异倍数大于2，但因为组内重复不好，可能会导致无差异；而另外一个基因，在一组中为100、110、120，另一组为45、50、55，可能就是显著差异的。
- BaseMean值比较低，即基因的丰度比较低，比如某个基因，在A组中的表达量均值为16，在B中的平均表达量为2，虽然差了8倍，但由于丰度低，可信度就低，很有可能也会判定为无差异。
解决方法：
- 对于第一种情况，尽量控制单一变量，比如取同一性别，同一亲本，同一发育时期的小鼠，并增加生物学重复；
- 对于第二种情况，建议增加数据量。
差异基因数目过多或者过少
通常差异基因的鉴定标准为|log2 Fold Change|＞1，即差异倍数在两倍以上，以及 P value＜0.05。当获得的差异基因数目较多，造成分析困难，想挖掘差异更显著的差异基因时，可以将我们的阈值调整的更加严格，例如 |log2 Fold Change|＞2，P value ＜ 0.01等；当我们获得的差异基因较少时，我们可适当放宽鉴定阈值，例如 |log2Fold Change| ＞ 0.5，但是P值需小于0.05才有显著意义。
为什么不同基因ID有着相同的蛋白注释？且为什么有相同蛋白注释信息的基因有的上调表达有的下调表达？
这是在分析结果中比较多见的现象，主要原因有两个：
- 多因一能：不同的基因通过注释具有相同的功能，而不同的基因其差异情况并不一样；
- 许多酶是复合物：组成酶的复合物包含了一个家族的多个基因和不同的调控因子，它们之间的调控机制尚不清楚，反映在图上会有部分上调，部分下调。
如何选取qPCR定量验证基因
- 根据GO或者是KEGG富集结果，或者是科研人员关注的基因，选取有代表性的进行qRT-PCR验证。
- 根据FPKM值，选择FPKM值差异倍数大，同时P值小的基因进行qRT-PCR验证。
qPCR结果和转录组测序结果不一致
RNA测序后，往往需要通过qPCR来进行验证。由于这两种实验的目的都是在检测基因的相对表达量。用qPCR验证的目的，是为了检测转录组测序结果的准确性。我们要求转录组和qPCR的结果趋势一样，比如转录组中显著上调，qPCR中也是显著上调。一般推荐先尽量多做几个，拿20-40个基因进行qPCR验证，因为不一定每个基因都会符合，尽管最后有几个不符合转录组的结果，我们舍去也无所谓，注意选取的基因尽量表达量不要太低，如果太低，无论转录组还是qPCR的准确性都会有所下降。
qPCR结果和转录组测序结果不一致，要考虑以下几个问题：
- 用于做转录组的样品和做qPCR的样品是同一个样品吗？不同生物学个体，虽然同样的处理，但个体差异也会导致不同。
- 样品在-80℃冰箱保存的时间或在液氮中保存的时间一样吗？且保存方式是否一样？即使同一个样品，保存时间与保存方式差异较大，也会有影响。
- 样品之间是否弄反？例如对照与处理之间，以及不同处理之间的样品是否出现弄乱的可能。
- 是否尝试过相同条件处理？不同批次的qPCR的测序？即使是相同处理，不同批次的qPCR结果也很可能不同，还有可能是由于生物个体之间本身的差异；
- 所选的基因是否丰度很低？如果丰度偏低，转录组测序和qPCR测序的结果都会受到影响。
- qPCR操作是否规范。定量实验对实验人员的操作，试剂的质量，实验环境都有着严格的要求。还有可能发生同一人员操作，得到两次的定量结果互相不一致的情况。
- 引物设计是否合理。在RNA-Seq中大多数基因会包含不止一个转录本，甚至有一些特别复杂的转录本形式，如果设计引物不合理就会使qPCR结果不准，还可能会有假基因的干扰。所以，qPCR的引物尽可能全都设计在基因的转录本共有外显子上，别是某些特定转录本的；引物设计好以后可以到NCBI做Primer Blast，保证引物不会Blast到一些基因组上的假基因上，避免假基因表达的干扰。
- 两种技术本身的差异。转录组测序与定量实验，都是检测基因表达情况的有效手段，但是两种技术在原理与方法上是不一样的，本身会存在一定概率结果不一致的可能。转录组测序一般是对基因进行定量，即所有来源于该基因的转录本的reads均归入该基因，而我们qPCR的设计的引物扩增片段有可能不能代表所有的转录本
好了，我们先说这么多，内容参考自《转录组学与多组学整合研究指南》，内容比较丰富，适合新手入门了解。电子书可搜索关注本人公众号BioparaMeta 回复 ‘干货’ 中(转录组链接)获取，除转录组也有宏基因组，单细胞转录组及编程资料可以获取，欢迎关注~~
