写在前面的话，饶毅老师曾经在公众号评论华大目前的测序仪和核心技术都是来自收购的美国CG公司，没有什么可炫耀的。无独有偶，测序技术开发一开始也并不是illumina的主业，他曾经也只是一家提供SNP基因分型的检测公司，直到2007年收购测序公司Solexa，illumina才逐步发展为现在我们所熟知的样子，所以称illumina一句“美国华大”可能再贴合不过了。网上其实有很多对illumina测序原理的介绍，都很详细，所以本期我们从illumina测序理解起来比较困难的几个问题来介绍。
Illumina的核心技术主要有两点：
- 通过加入3’ 端可逆封闭基团的修饰核苷酸（“base by base”）来进行边合成边测序
- 成簇（DNA colony sequencing）：通过固相支撑的桥式扩增实现克隆扩增，实现信号放大的作用。
这两大技术分别来自1990年和1998年的两项专利，分别归属于Solexa和Manteia公司，后来Solexa后来通过收购Manteia，整合了两项技术，这些构成了illumina的测序技术基础。
专利1
专利2
测序方法采用边合成边测序的方法（SBS）。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。相较于焦磷酸法测序，由于其使用的是dNTP没有封闭功能，每次只能通过加入一种dNTP来实现单碱基延伸。所以Illumina的这种可逆终止子的测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题 (Homopolymer错误)。
测序方法
测序前进行桥式PCR成簇。桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增(35X)。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大（如图所示，和我们小时候玩的光纤灯一个原理，一根光纤的亮度是有限的，但是攒成一把后亮度就极大增强），以达到测序所需的信号要求。
成簇
本期就介绍illumina的两大核心原理，如果有介绍不全或者不懂的地方可以提出您的问题。下一期我们解答一下为什么测序需要构建测序文库，以及构建测序文库中各项指标的意义。
参考文献：
Illumina, Inc. - Wikipedia (jinzhao.wiki)
DNA sequencing - Wikipedia (jinzhao.wiki)
Bibliographic data: WO9106678 (A1) ― 1991-05-16 DNA SEQUENCING Kawashima, Eric H.; Laurent Farinelli; Pascal Mayer [fr] (12 May 2005). "Patent: Method of nucleic acid amplification"
