RNA-seq

转录组

转录组学（transcriptomics）的研究对象是全基因组尺度下所有转录本（transcript），即转录组（transcriptome）

转录本测定研究

基于杂交的基因芯片技术

将荧光标记的cDNA制成微阵列探针来测定样本中特定转录本含量。又称为 基因芯片（Gene Chip）、微阵列（Microarry）。

获取表达量的步骤：

提取RNA -> 反转录 （->扩增）->标记->杂交->扫描->获得原始数据

局限性：

• 只能检测已知或确定性的序列

• 无法检测新发现的，未放置到芯片上的基因

• 有部分探针的信号可能会受到非特异性杂交或个体序列差异的影响

基于NGS的RNA-seq

基于高通量二代测序技术的转录组学研究方法。

特点：

高通量、低成本；不依赖已知转录本探针，可以测全转录组；对于低表达丰度的转录本灵敏

度高；以reads数量腐酸表达，比芯片的荧光信号更为精确。

应用和最新进展

• 差异表达分析
  
• 可变剪接
  
• 共表达网络
  
• 转录调控网络
  
• 根据文库构建方法带来的变种
  

• ssRNA-seq

• small RNA-seq

• ribo-zero-ssRNA-seq

• circ-RNA-seq

RNA-seq 试验设计

1. 生物学重复
   生物学重复用于排除随机误差，通常3~5个，不同性质的样本可能需求重复量不同
   
2. 样本提取
   液氮或转录阻断剂瞬时猝灭，低温保存，长时间保存可能会降解
   
3. 文库构建
   非链特异性文库 RNA-seq：无法区分打碎的片段转录自正义链还是反义链；
   链特异性文库 ssRNA-seq：建库时保留了转录本方向信息。基因表达定位更准确，可变剪切、双向转录等。
   
4. 测序策略
   单端测序 single-end：通常用于特殊测序，如small RNAseq；
   双端测序 pair-end：有利于基因注释、转录本异构体鉴定。
   
5. 测序深度
   ENCODE推荐不进行可变剪接时，仅计算表达量最少 5M 有效 reads，如果需要鉴定新转录本、检测低表达基因、检测可变剪接等，需要适当增加测序深度。普通双端150bp测序平台有参转录组测序通常 6Gb数据，特殊文库需要数据倍增。
   
6. 测序平台
   

RNA-seq 文库制备

1. 总RNA提取
   将 RNA 从特定组织中分离并与脱氧核糖核酸酶混合，降解样本中的DNA，然后用凝胶和毛细管电泳检测 RNA 降解量，评估 RNA 样本质量。
   

依据文库要求检查完整性分值，如果不合格将不适合建库测序。一些特殊文库对RNA提取要求很高，如全长转录组文库，需要特殊提取流程保证RNA 完整性。

2. RNA分离纯化
   

• poly A 富集（RNA-seq 常用策略）

• rRNA 移除（rRNA占细胞中总RNA的比例超过90%）

• small RNA 富集

• circRNA 富集

• 其他等

3. 样本打断
   

打断方法：酶切、超声波处理、喷雾器

4. cDNA合成
   

是否用标记保留链特异信息？

5. 上机测序
   

转录组核心数据分析

数据获取

需要的数据：参考基因组数据fasta、GFF注释信息、双端测序的fastq文件

（我这里用的是普通栽培稻(Oryza sativa L.)的参考基因组、GFF文件和PRJNA797556项目数据。）

参考步骤：https://blog.csdn.net/sunchengquan/article/details/79781366

批量下载和处理多行SRA序列时可以利用脚本：

• 需要批处理的文件列表file.list
  
• 批处理脚本：
  
• 
  

#!/bin/bashfor name in $(cat $1)do    echo ${name}    fastq-dump --split-3 ${name}done

批处理运行命令：

bash bash_fastq_dump.sh file.list

注意：配置时，需要在bin目录下执行./vdb-config --interactive，然后弹出一大堆乱七八糟的之后，按X退出即可。再执行./fastq-dump，若没有报错，而是帮助信息的话即可以使用。