当有了聚类结果（cluster）或注释结果（celltype）后就可以 找不同cluster/celltype间，不同样本间 或者 不同分组间的差异，为后面的 机制探索 或者 样本间/组间异质性研究 提供一些帮助。
但是在对差异结果进行可视化的时候，你是否经常会遇到以下情况，
1）单细胞数据的火山图 中间经常会缺一块 ？Y轴最高处会堆积很多点？
2）除bulk常见的火山图外，文献中是否还有什么其他的展示形式？
3）可以同时展示单细胞各个cluster /celltype的差异情况吗？
一 差异marker分析
Seurat可以通过FindMarkers函数 和 FindAllMarkers函数寻找不同cluster的差异表达基因。
1 FindMarkers函数
1.1 特定cluster/celltype 与其他的差异
是one-others的差异分析方法，由ident.1来制定cluster/celltype ，然今后计算ident.1与其他所有的差异。本例就是Epi与其余的所有celltype找差异marker。
library(Seurat) library(tidyverse) #载入数据 load("sce.anno.RData") #设置颜色 colour=c("#DC143C","#0000FF","#20B2AA","#FFA500","#9370DB","#98FB98","#F08080","#1E90FF","#7CFC00","#FFFF00", "#808000","#FF00FF","#FA8072","#7B68EE","#9400D3","#800080","#A0522D","#D2B48C","#D2691E","#87CEEB","#40E0D0","#5F9EA0", "#FF1493","#0000CD","#008B8B","#FFE4B5","#8A2BE2","#228B22","#E9967A","#4682B4","#32CD32","#F0E68C","#FFFFE0","#EE82EE", "#FF6347","#6A5ACD","#9932CC","#8B008B","#8B4513","#DEB887") # find all markers of cluster Epi cluster1.markers <- FindMarkers(sce2, ident.1 = "Epi", min.pct = 0.25) head(cluster1.markers, n = 5)
# p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj
# MXRA8 0 -1.5057649 0.024 0.385 0
# MFAP2 0 -0.8893903 0.020 0.279 0
# C1QA 0 -3.0473042 0.048 0.333 0
# C1QC 0 -2.5871212 0.022 0.273 0
# C1QB 0 -3.0683349 0.043 0.316 0
1.2 指定cluster/celltype 之间的差异
示例为计算Epi 和 T + B 细胞之间的差异
cluster2.markers <- FindMarkers(sce2, ident.1 = "Epi", ident.2 = c("T", "B"), min.pct = 0.25) head(cluster2.markers, n = 5)
FindMarkers函数常用参数：
min.pct: 基因在两个cluster/celltype中任何一个被检测到的百分比阈值，默认0.1 。
logfc.threshold ：默认为0.25
thresh.test：设定基因在两个cluster/celltype中基因差异表达量。
test.use ：差异marker的检验方式，默认为“wilcox”，可选“bimod”，“roc”，“t”，“negbinom”，“LR”，“MAST”，“DESeq2”等；
only.pos：是否仅返回阳性标记（默认为FALSE）
更多参数可以使用 ??FindMarkers 查看。
2 FindAllMarkers 函数
每个cluster/celltype 分别与其他所有cluster/celltype 进行比较，展示各个cluster/celltype 的前2个基因
sce2.markers <- FindAllMarkers(sce2, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25) sce2.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_log2FC)
p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene 1 1.88e-117 1.08 0.913 0.588 2.57e-113 0 LDHB 2 5.01e- 85 1.34 0.437 0.108 6.88e- 81 0 CCR7 3 0 5.57 0.996 0.215 0 1 S100A9
注意FindAllMarkers比FindMarkers的结果多了cluster列，结果为该cluster与其他所有cluster相比的差异基因。
FindAllMarkers 与 FindMarkers 参数类似，但是需要注意only.pos的默认值， only.pos：仅返回阳性标记（默认为TRUE）
二 ，可视化-火山图
1，常规方式绘制火山图
#自定义阈值 log2FC = 1 padj = 0.05 cluster1.markers$threshold="ns"; cluster1.markers[which(cluster1.markers$avg_log2FC > log2FC & cluster1.markers$p_val_adj <padj),]$threshold="up"; cluster1.markers[which(cluster1.markers$avg_log2FC < (-log2FC) & cluster1.markers$p_val_adj < padj),]$threshold="down"; cluster1.markers$threshold=factor(cluster1.markers$threshold, levels=c('down','ns','up')) ggplot(data=cluster1.markers, aes(x=avg_log2FC, y=-log10(p_val_adj), color=threshold)) + geom_point(alpha=0.8, size=0.8) + geom_vline(xintercept = c(-log2FC, log2FC), linetype=2, color="grey")+ geom_hline(yintercept = -log10(padj), linetype=2, color="grey")+ #labs(title= ifelse(""==title, "", paste("DEG:", title)))+ xlab(bquote(Log[2]*FoldChange))+ ylab(bquote(-Log[10]*italic(P.adj)) )+ theme_classic(base_size = 14) + scale_color_manual('',labels=c(paste0("down(",table(cluster1.markers$threshold)[[1]],')'),'ns', paste0("up(",table(cluster1.markers$threshold)[[3]],')' )), values=c("blue", "grey","red" ) )+ guides(color=guide_legend(override.aes = list(size=3, alpha=1)))
更多颜色，参数的设置以及如何添加感兴趣的基因详见ggplot2-plotly|让你的火山图“活”过来 和 火山图|给你geneList，帮我标到火山图上。
回答开始提出的问题1:
（1）因为单细胞自身区别于bulk数据的特异性，大概率会出现很多P值为0或者无限接近于0的基因，绘制常规火山图就会出现Y轴顶出现很多点。
（2）中间的空白是因为FindMarkers的默认参数含还有很多阈值，很多基因被过滤掉了。可以通过调整min.pct，logfc.threshold 和thresh.test等参数得到更多的基因，自行尝试比较。
2， 单细胞火山图展示方式
在生信技能树 两个不同单细胞亚群差异分析，何必一定要做火山图 中提到NC文章 《CD177 modulates the function and homeostasis of tumor-infiltrating regulatory T cells》有以下呈现方式，横坐标使用cluster/celltype间的pct差值，纵坐标使用log2FC ，P值可以使用颜色来表示。 
文献阈值参数：Genes labeled have logfold change > 1, Δ Percentage Difference > 20% and adjusted P-value <0.05.
使用ggplot2 点图绘制方式
library(ggrepel) cluster1.markers <- cluster1.markers %>% mutate(Difference = pct.1 - pct.2) %>% rownames_to_column("gene") ggplot(cluster1.markers, aes(x=Difference, y=avg_log2FC, color = threshold)) + geom_point(size=0.5) + scale_color_manual(values=c( "blue","grey","red") ) + geom_label_repel(data=subset(cluster1.markers, avg_log2FC >= 1 & Difference >= 0.2 & p_val_adj <= 0.05), aes(label=gene), #添加label color="black", #设置label中标签的颜色 segment.colour = "black",#设置label框的颜色 label.padding = 0.1, #max.overlaps = 200, segment.size = 0.3, #框的大小 size=4)+ geom_label_repel(data=subset(cluster1.markers, avg_log2FC <= -1 & Difference <= -0.2 & p_val_adj <= 0.05), aes(label=gene), label.padding = 0.1, color="black", segment.colour = "black", segment.size = 0.3, size=4)+ geom_vline(xintercept = 0.0,linetype=2)+ geom_hline(yintercept = 0,linetype=2)+ theme_classic()
这样就解决了传统火山图 上限一行点的问题，然后可以根据ggplot2的一些参数进行细节的调整和美化。
此外单细胞还有一个特性就是有很多celltype ，那需要像NC文章那样每种cluster绘制一张图吗？是否有方式可以同时展示所有cluster的差异？
3 所有cluster热图
如文献A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human HeartsciPainter中的Fig2-D所示 ，提出了同时展示所有cluster差异基因的方式
这里介绍一种简单实现的方式，推荐老俊俊封装的scRNAtoolVis-R包，可以一行代码简单出图 jjVolcano 一行代码绘制单细胞火山图，可以去大佬的github star一下哈
支持和鼓励:
#install.packages('devtools') #devtools::install_github('junjunlab/scRNAtoolVis') library(scRNAtoolVis) jjVolcano(diffData = sce_marker, log2FC.cutoff = 0.25, size = 3.5, #设置点的大小 fontface = 'italic', #设置字体形式 #aesCol = c('purple','orange'), #设置点的颜色 tile.col = colour, #设置cluster的颜色 #col.type = "adjustP", #设置矫正方式 topGeneN = 5 #设置展示topN的基因 )
还可以通过polar函数调整形状
jjVolcano(diffData = sce_marker, tile.col = colour, size = 3.5, topGeneN = 5, fontface = 'italic', polar = T) + ylim(-8,10)
